猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株全基因组的克隆和序列分析

分离了9株猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）广东地方分离株，并进行了全基因组序列测定；对这9株PCV2广东分离毒株的ORF1和ORF2基因的序列分析表明ORF2的变异程度要比ORF1的变异程度大；对PCV2衣壳蛋白的氨基酸序列同源性比较发现了PCV2毒株间存在1个氨基酸变异程度较大的区域和2个氨基酸变异程度较小的区域，其中前两个区域与两个主要的免疫反应区域相对应；将这9个毒株的全基因组序列与GenBank上收录的18个PCV2毒株的全基因组序列基因进化树分析表明，这9个PCV2广东分离株彼此之间及与国内PCV2分离株、欧洲株之间更接近，而与韩国、中国台湾、日本和美洲毒株之间则稍远，因而在选PCV2疫苗免疫时，建议尽量使用国内生产的疫苗或自制组织灭活疫苗进行免疫。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。     

四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型（PCV2）当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株（SMU-2022）的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%～99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。     

2010-2013年四川地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查

为了掌握四川地区近年猪圆环病毒(PCV2)的分子流行和分子进化动态规律。将2010-2013年期间采集自四川成都、德阳、雅安、西昌、遂宁、乐山、资阳等11个养猪地区的疑似PCV2病料共324份进行了检测与分析。设计1对检测PCV2的特异性引物,PCR检测病料表明PCV2阳性为229份,PCV2感染率为70.7%。随后对本实验室分离到的11株PCV2分离毒株进行全基因组克隆与序列分析,11株PCV2四川分离株的全基因组序列分析均为PCV2b基因型,各地分离株之间的全基因同源性为95.2%⁹9.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%99.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%⁹9.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%99.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%¹00%、98.4%100%、98.4%¹00%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%100%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%⁹9.7%、85.4%99.7%、85.4%¹00%,序列分析发现ORF2变异位点较多,而ORF1相对较保守。本研究结果显示:2010-2013年间,四川地区PCV2感染率高,主要分布在乐山、德阳等市,且流行的基因型以PCV2b为主。     

猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

为了解北京地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2010年病料中分离的2株PCV2通过PCR、IPMA进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar进行序列分析,用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对,构建系统进化树。结果表明,分离得到的BJ2010LC株(登录号为JQ002671)、BJ2010PG株(登录号为JQ002672)2个PCV2毒株其全基因组长度均为1 767bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.2%～99.5%,2个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.6%。BJ2010LC株属于基因型PCV2d,BJ2010PG株属于基因型PCV2b。     

猪圆环病毒2型细胞毒(MNS株)的驯化及全基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)与参考毒株之间在分子生物学水平上的差异以及病毒驯化过程中的遗传变异情况,将分离的猪圆环病毒2型MNS株在PK-15细胞上盲传35代,并对4个代次病毒全基因组进行测序与分析。间接免疫荧光试验结果表明,感染细胞的细胞核中可以观察到特异性绿色荧光。病毒传代驯化到第35代后,病毒对细胞的适应性显著提高,病毒含量最高可达107TCID50/m L。对4个代次接种病毒Z0、Z3、Z19、Z35进行全基因组测序,结果表明,4代次细胞毒与PCV2参考毒株之间的全基因组序列同源性为93.9%~96.3%,与参考株af55394(PCV2b)核苷酸同源性较高。4代次细胞毒之间全基因组序列同源性为99.7%~99.9%,通过分析PCV2全基因组中碱基突变结果,发现各代次细胞毒与参考毒株之间存在19处点突变,16处点突变发生在ORF1中,3处发生在ORF2中。其中,ORF1 751~753 nt处发生基因颠换(TACGC→TTTTG)现象。本研究结果对今后进行PCV2复制机制、遗传变异以及开发高效价的病毒灭活疫苗等方面的研究奠定了基础。     

两株死胎源猪圆环病毒Ⅱ型的分离与序列分析

将两猪场Ⅱ型猪圆环病毒(PCV2)核酸阳性的流产死胎病料,接种猪肾传代细胞PK15,成功分离到2株PCV2。利用1对PCV2特异性引物,成功扩增出这2株PCV2长约1700bp的全基因组序列,并与其他PCV2毒株序列进行相似性比较。结果表明:2个分离株全基因组长度均为1767bp,核苷酸序列相似性为99.9%;ORF2基因核苷酸相似性为99.85%,所编码的衣壳蛋白氨基酸序列相似性为100%;2个分离株与SD-3等国内分离株核苷酸序列的相似性较高,最高可达99.9%。     

5株湖南猪圆环病毒1型全基因组测序与遗传进化分析

为了解湖南猪群猪圆环病毒1型（PCV1）的遗传变异情况,以PCV1阳性DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV1全基因序列并进行拼接。结果共获得5个PCV1全基因组,其中3株全基因大小为1 759 bp,另外2株分别为1 758 bp和1 760 bp。5株全基因组同源性为98.4%~99.7%,与国内外的PCV1全基因组同源性为98.1%~99.7%;ORF2序列同源性为97.6%~99.6%,与国内外的PCV1 ORF2同源性为96.1%~99.9%。系统发育树显示,5株PCV1均属于同一分支,并显示出一定的地理差异,但差异较小。结果表明,湖南省流行的PCV1毒株基因较为稳定,分离株间差异较小。本研究为湖南省猪圆环病毒病防控及相关研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型贵州株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采自贵州长顺、清镇和仁怀地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病料进行了猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组扩增、克隆和测序分析。结果表明:所扩增克隆的3株PCV2中,GZ-QZ1(JQ809463)和GZ-RH1(JQ809464)2个PCV2毒株基因组全长为1 767 bp,GZ-CS1(JQ809462)株为1 768 bp;3株PCV2之间的核苷酸序列相似性介于94.5%⁹9.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%99.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%⁹9.9%;全基因组序列比对分析表明,GZ-QZ1和GZ-RH1两个毒株属于PCV2b,GZ-CS1株属于PCV2a。对3株病毒编码Cap蛋白的ORF2基因分析发现,GZ-QZ1和GZ-RH1毒株与GZ-CS1毒株相比在696位缺失了一个碱基A,导致移码突变,使得末端氨基酸序列变由L K P变为L N P R。     

广西某市屠宰猪淋巴结猪圆环病毒3型的病原检测及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在广西地区健康猪群中的遗传变异情况,对广西某市屠宰场健康猪的181份淋巴结进行PCV3的病原检测,结果 PCV3阳性率为24.31%。这说明在健康屠宰猪群中PCV3的感染率较高,带毒情况较为严重。对其中的阳性样品进行全序列扩增,最终得到6条PCV3全基因组序列。将试验所得PCV3全基因组序列与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组序列相比较,结果发现PCV3全基因组相似性为98.6%~99.9%,变异程度低,较为保守;对PCV3ORF2基因进行遗传演化分析,发现PCV3毒株可分为两大型。通过对PCVs(PCV1、PCV2和PCV3)Cap蛋白相似性进行比对分析,推测PCV2与PCV3不具有交叉保护性。     

PMWS患病猪和健康猪感染的PCV2序列比较分析

根据GenBank中已发表PCV2全基因序列,设计1对特异性引物,建立扩增PCV2全基因的PCR方法。用该方法从山东、河北、安徽、甘肃4个省份的4份PMWS患病猪的阳性病料和山东德州、南京、北京、甘肃、甘肃泉州和白银5个屠宰场的7份健康猪阳性样品中直接扩增出11个PCV2全基因片段。将扩增片段克隆于pMD18-T载体,并通过双酶切的方法筛选获得了11个阳性重组质粒,分别命名为SDPCV、HBPCV、AHPCV、GSPCV、DZPCV1、DZPCV2、DZPCV3、NJPCV、BJPCV、BYPCV和QZPCV。测序结果分析表明,除了BJPCV和GSPCV2株PCV2基因组全长为1768bp外,其余9株基因组全长均为1767bp。应用DNAstar序列分析软件,对测定的11个PCV2序列与GenBank中登录的10个不同地区的代表毒株进行同源性比较,发现健康猪群感染毒株的全基因组序列和ORF2及其氨基酸序列同源性比患病猪群略高,ORF1、ORF3及其相应氨基酸序列同源性在2类猪群中则没有明显差异。系统发生进化树显示,DZPCV3与其他10株PCV2亲缘关系较远,但与山东分离株AY556473亲缘关系接近,共同构成一个独立分支;其余10株PCV2之间关系密切,都分布于一个独立的小分支中,并与法国分离株亲缘关系接近。患病猪群和健康猪群感染的PCV2在基因进化树上交错分布,表明2类猪群感染的PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异。     

猪圆环病毒2型GZ-RH1株基因组遗传特征分析

为对猪圆环病毒iDNA新型疫苗、基因组遗传变异以及基因组结构与功能等研究提供科学依据,运用相关生物信息学软件对猪圆环病毒2型(PCV2)贵州仁怀分离株(GZ-RH1)的基因组遗传特征进行了分析。结果表明,PCV2GZ-RH1株基因组结构与pmws(AF027217)株相比存在较大差异,其ORF2基因的第696位因碱基T的缺失而导致移码突变,致使其缺失了ORF8和ORF11,ORF5和ORF10终止密码子提前,其他ORF相对较为保守。PCV2GZRH1株各编码蛋白中除了ORF4和ORF9外,其余都属于亲水性蛋白,且ORF9含有1段信号肽序列。在ORF1和ORF2编码蛋白的磷酸化位点中,ORF1相对较为保守,而ORF2变异较大。ORF1~3所编码的蛋白除均具有各自的蛋白质家族域外,还预测到一些可能具有特殊功能的结构域,如ORF1编码蛋白的NACHT结构域和ORF2编码蛋白的精氨酸富集区。ORF2编码氨基酸位点熵值分析表明,ORF2蛋白氨基酸序列中包含2个高变区,即第53~91位和185~215位。通过构建进化树显示,GZ-RH1分离株系PCV2b亚型。对GZ-RH1株的密码子偏爱性分析表明,相对于大肠杆菌和酵母而言,昆虫细胞更适合于PCV2ORF2基因的体外表达。     

猪圆环病毒2型广东分离株ORF2基因的克隆和序列分析

为了解广东部分地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株的基因型和遗传变异情况,本研究根据GenBank中PCV2的核苷酸序列设计针对ORF2基因的1对特异性引物,从分离于广东省的8株PCV2分离株BL、HD、Li、GD01、GD02、HD01、HD02和HD03株的细胞培养物中扩增ORF2基因,扩增片段克隆到pMD18-T上,获得重组质粒,并对其进行测序。序列分析结果表明,8株PCV2分离株ORF2基因与其他PCV2 ORF2基因核苷酸序列同源性为89.7%~100%,氨基酸序列同源性为87.2%~99.6%,进化分析结果表明,其中7株分离株处于同一分支,属于PCV2b-1A/1B,HD01株属于PCV2b-1C。     

2013~2017年江西省猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为掌握江西地区猪圆环病毒2型（PCV2）的分子流行病学及其遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2017年采集自江西省南昌市、宜春市、新余市、赣州市、吉安市、九江市、上饶市、抚州市、景德镇市、鹰潭市等10个地区的1 082份疑似PCV2感染猪病料组织进行病原学检测,并通过PCR扩增、克隆和基因测序对PCV2的全基因组序列进行分析。研究表明,1 082份病料中有610份为PCV2阳性,总阳性率为56.4%,其中2013~2017年阳性率分别为52.7%、48.8%、58.5%、71.0%和67.4%。共获得89株PCV2全基因组序列,其中有83株为PCV2b基因型,其中53株归类于PCV2b-1C基因亚群,30株归为PCV2b-1A/1B基因亚群;6株为PCV2a型。测序毒株与参考毒株ORF2基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.9%~100.0%和86.0%~100.0%;氨基酸序列分析表明,Cap蛋白存在20个氨基酸突变位点。本研究表明,江西地区猪群中PCV2的主导基因型为PCV2b,其中又以PCV2b-1C基因亚群占据主导地位,同时也存在少量PCV2a基因型。     

广西壮族自治区猪圆环病毒2型（PCV2）分子流行病学调查及遗传变异分析

[目的]了解猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）在广西壮族自治区的流行情况及遗传特征。[方法]采用PCR方法对广西壮族自治区不同地区送检的病料进行PCV2检测和全基因组序列扩增。应用BioEdit、Mega 7.0、RDP 5和SimPlot(ver 3.5.1)软件对获得的24株PCV2毒株全基因组序列进行核苷酸序列相似性、遗传变异和重组分析,并对Cap蛋白氨基酸序列变异位点进行分析。[结果]PCV2广西株基因组大小均为1 768 bp;核苷酸序列相似性分析显示,广西株与参考株PCV1～PCV4的相似性在44.7%～99.7%,与PCV3亲缘性最低;广西株为PCV2b和PCV2d型,PCV2d流行最为广泛;全基因组序列重组分析显示,部分广西株存在重组事件;与疫苗株AY686764-PCV2b和HM641752-PCV2b相比,PCV2广西株的Cap蛋白氨基酸序列共有21个位点发生变异。[结论]PCV2广西流行毒株以PCV2d型为主,部分毒株具有重组现象,部分位点发生独特的氨基酸变异,遗传进化趋势明显。研究结果为广西壮族自治区PCV2的流行病学...     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

1株圆环病毒3型美国毒株全基因组克隆与遗传演化分析

为了解进口美国种猪中获取的猪圆环病毒3型(PCV3)毒株全基因组序列及遗传变异情况,根据GenBank中收录的PCV3基因组序列,设计2对特异性引物,对确诊感染PCV3的病死猪组织进行全基因组序列扩增、拼接、测序和序列分析。结果显示,获得的PCV3美国毒株(命名为PCV3_USA2021,GenBank登录号OL799306)全基因组序列长度约为2000 bp,与国内外不同地区的38个PCV3参考毒株同源性为98.7%~99.8%。其中,PCV3_USA2021株开放阅读框ORF1和ORF2与国内外38个参考毒株同源性分别为99.1%~99.9%和98.0%~100%。构建的全基因组系统进化树显示,该毒株为PCV3a亚型,与美国毒株(PCV3-US_SD2016)亲缘关系最近。本研究为PCV3的遗传变异、流行病学分析提供了参考,也为相关疫苗的研制打下了基础。