水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析

试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体，且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析，为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因，采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒；利用BLAST程序进行同源性分析，Mega 7.0构建系统进化树，ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装，经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒，将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b，并进行病毒滴度测定；利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞，实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测，对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示，试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列，通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%，与其他物种同源性较高，和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示，pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒，病毒滴度为3.367×10¹⁰ GFU/mL，感染卵丘细胞后，实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高（P<0.01）。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析，发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。     

水牛miRNA-155重组腺病毒载体的构建及生物信息学分析

旨在利用Admax系统构建miRNA-155的腺病毒表达载体,获得含有miR-155的腺病毒颗粒,同时对miR-155的预测靶基因进行生物信息学分析,为研究水牛卵丘细胞中miRNA-155的功能奠定基础。根据GenBank中牛的序列,通过RT-PCR扩增得到pri-miRNA-155序列,并连接到腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP,测序并进行生物信息学分析。将pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155与pBHGloxdelE13cre在HEK-293细胞中包装获得Ad-miRNA-155病毒颗粒,感染水牛卵丘细胞后,利用RT-qPCR技术检测miRNA-155及部分靶基因表达量。TargetScan网站预测获得miRNA-155的靶基因,并利用KOBAS 3.0对预测靶基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明,成功构建腺病毒重组载体pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155,水牛pre-miR-155与黄牛、马、家兔、原鸡、猕猴、狼、树鼩的同源性均达95%以上,且miR-155在进化过程中高度保守。Ad-miR-155感染水牛卵丘细胞后,miR-155的表达水平显著上升(P0.01),预测靶基因Wee1、CD44、TRPS1表达水平显著降低(P0.01)。最后对miR-155预测靶基因进行生物信息学分析发现,miR-155可能通过PI3K-AKT、mTOR及MAPK等信号通路作用于卵丘细胞进而调控水牛卵母细胞体外成熟。     

hsa-miR-21-5p靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对hsa-miR-21-5p的序列保守性和靶基因进行生物信息学分析,为进一步探讨其在卵母细胞成熟过程中的功能及调节机制提供思路。【方法】从GEO数据库获取人卵母细胞不同成熟阶段对应的卵丘细胞基因表达谱数据(GSE31681),利用R软件筛选差异表达基因(DEGs),通过FunRich软件预测DEGs的靶向miRNAs,找出hsa-miR-21-5p靶向的DEGs,获得miRNA-mRNA关系对;利用BLAST程序进行相似性比对,通过Mega 11.0软件构建系统进化树,采用ViennaRNA Web Services预测pre-miR-21-5p的二级结构;使用miRTarBase网站预测hsa-miR-21-5p靶基因,并进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过STRING数据库建立蛋白质互作网络,并利用Cytoscape软件进行可视化分析。【结果】共筛选出7个卵母细胞成熟过程中GV/MⅡ期对应卵丘细胞中hsa-miR-21-5p靶向的DEGs。对物种间miR-21-5p序列分析发现,人pre-miR-21-5p与小鼠、褐家鼠、黄牛、绵羊、笔尾树鼩、猕猴的相似性均达9...     

水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析

本研究旨在建立水牛卵母细胞体外成熟培养前后GV/MⅡ(Germinal vesicle,GV)/(MetaphaseⅡ,MⅡ)期对应的卵丘细胞miRNA数据库,筛选两个时期差异表达的miRNAs,为进一步阐明miRNA通过调控卵丘细胞中基因表达进而在卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用提供科学依据。分别收集水牛GV/MⅡ期的卵丘细胞,提取总RNA,利用Solexa测序技术获取小RNA测序数据,并进行生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了GV/MⅡ期卵丘细胞miRNA的表达谱,发现相对于GV期卵丘细胞,miRNA在MⅡ期卵丘细胞中表达差异显著上调的有24个,表达差异显著下调的有45个。采用qRT-PCR技术对随机筛选的8个miRNAs进行验证,证实其表达水平和RNA-seq分析结果相一致。结合靶基因预测和KEGG富集分析,获得了276条显著富集的信号通路;同时对富集前20的信号通路进行归纳总结,推测差异表达的miRNAs主要是通过细胞增殖、凋亡,物质代谢,细胞连接等途径在卵丘细胞中发挥作用。     

miR-193a在MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

本试验旨在研究miR-193a在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cp BVDV)感染MDBK细胞过程中诱导细胞凋亡的分子机制。试验利用TargetScan和Microcosm Targets等生物信息学在线软件预测凋亡相关的miR-193a靶基因Bax,并利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-193a的靶基因;用过表达miR-193a的慢病毒pre-miR-193a-lv和抑制miR-193a表达的慢病毒pre-miR-193a-inhibitor-lv分别侵染MDBK细胞,48 h后收集细胞,然后用实时荧光定量PCR、Western blotting和流式细胞仪检测凋亡通路中Bax的表达水平及MDBK细胞凋亡率。结果预测并验证了miR-193a的靶基因为Bax;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-193a能直接结合到Bax 3'UTR区域中的miRNA反应位点,并极显著下调Bax的表达水平(P<0.01);流式细胞仪检测凋亡率结果显示,感染pre-miR-193a-lv慢病毒的MDBK细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。结果表明miR-193a能直接靶向凋亡通路中Bax基因,从而促进凋亡的发生。     

腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较

试验旨在比较腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的效率。将腺病毒质粒pBHGloxdelE13cre、pDC316-eGFP脂质体转染293细胞,收集病毒并测定病毒滴度。用腺病毒载体按不同的感染复数（MOI）感染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞,72 h后倒置荧光显微镜下观察,统计感染效率。MOI为25、50、100、200、400时,成纤维细胞感染效率分别为0.7%、7.0%、9.0%、12.5%、34.0%,卵丘细胞感染效率分别为42.5%、55.3%、57.4%、76.0%、80.0%,乳腺上皮细胞感染效率分别为88.7%、100%、100%、100%、100%。结果表明,腺病毒转染乳腺上皮效率最佳,卵丘细胞次之,成纤维细胞效果较差。     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10⁶TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞(iPSC)。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10~6TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

慢病毒介导牛pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型建立研究

为了通过慢病毒感染的方法建立pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型,从而研究miR-29b在动物模型体内过表达对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制的影响,试验根据miRBase数据库中牛miR-29b前体pre-miR-29b序列设计引物,以MDBK细胞全基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-29b基因,并克隆至空质粒pLL3.7中;共同转染pLL3.7-pre-miR-29b及慢病毒包装辅助质粒(pRSV-Rev、pCMV-VSVG和pMDLg/pRRE)至HEK-293T细胞中,于48,72小时时收集病毒液,浓缩后接种至HEK-293T细胞中进行慢病毒效价测定。将6只Balb/c小鼠平均分成2组,即空质粒pLL3.7感染组和慢病毒pLL3.7-pre-miR-29b感染组,每只小鼠尾静脉注射5.0×10~7 infection units(IU)/mL病毒液,于注射后96小时时处死小鼠,采集肝脏、脾脏、肾脏等器官,提取总miRNA,并反转录成cDNA,使用TaqMan荧光定量RT-PCR法检测miR-29b在小鼠不同器官中的表达情况。结果表明:试验成功扩增得到牛pre-miR-29b并构建出pLL3.7-pre-miR-29b;成功包装pLL3.7-pre-miR-29b慢病毒,其效价为5.8×10~8 IU/mL;经尾静脉注射慢病毒后,在慢病毒pLL3.7-pre-miR-29b感染的小鼠不同器官中均有较高水平的miR-29b表达。说明试验成功建立了慢病毒介导牛pre-miR-29b表达的Balb/c小鼠模型。     

鸡miR-125b的组织发育性变化及其功能预测分析

为了解miR-125b的进化历史和潜在的生物学功能,下载不同物种miR-125b前体序列,运用Clustal W2软件进行多序列比对,构建系统进化树,q PCR方法检测固始鸡不同组织中miR-125b表达量的发育性变化,通过Targetscan 7.0与miRDB数据库对miR-125b靶基因进行预测、DAVID数据库对预测的靶基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果显示:不同物种之间miR-125b具有很高的保守性;在胚胎期下丘脑中,随着胚胎发育,miR-125b的表达量逐渐增加,出壳后又呈现逐渐降低的趋势,到36周龄表达量又显著升高;在成年期消化器官(肌胃、腺胃、小肠、肝脏)中也具有较高的表达量;经预测,miR-125b靶基因有920个,富集于组织发育、生物调节、基因表达的转录后调节、小RNA的生物学加工等生物过程和细胞外基质受体相互作用、调节肌动蛋白细胞骨架、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成和NOD样受体信号等通路。结果表明:鸡miR-125b为广泛性时序表达miRNA,可能参与鸡胚胎期及出壳后生长发育相关的诸多生物学过程的调控。     

水牛卵丘颗粒细胞凋亡与卵母细胞体外发育潜能的研究

为了探讨水牛卵母细胞体外发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系,本研究将水牛卵母细胞体外培养22～24 h后,取其卵丘颗粒细胞,采用Annexin V-FITC法进行颗粒细胞凋亡染色,进行凋亡率的分析,并与卵母细胞的成熟情况和卵母细胞的评分及形成卵裂、囊胚的结果进行对照.结果发现,随着卵母细胞成熟时间的增加,卵丘颗粒细胞凋亡率升高;随着卵母细胞评分和发育潜能的降低,卵丘颗粒细胞凋亡率逐渐升高.由此表明,卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡密切相关,通过测定卵丘颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能.     

香猪睾丸miR-449b和miR-222分子的发育性变化

为了阐明miR-449b和miR-222对贵州从江香猪睾丸发育的调节作用。运用qPCR方法检测香猪睾丸组织中miR-449b和miR-222表达量的发育性变化,通过miRSystem数据库、Kobas数据库对预测的靶基因进行信号转导通路富集分析。经克隆测序,得到香猪miR-222序列,与猪的相似性为100%,而且物种之间miR-449b和miR-222两个分子的保守性都很高。香猪睾丸中miR-449b于1~4月龄期间的表达量逐渐上升,4月龄时表达量达到峰值,之后下降;miR-222的表达量呈现相反的变化趋势,于1~4月龄期间表达量逐渐下降,1月龄时最高,4月龄时最低,之后的表达量有所回升;已知物种的miR-449b和miR-222序列高度保守;经预测miR-449b靶基因有420个,富集于卵母细胞减数分裂、Notch信号通路、Ras信号通路等100个途径(P0.05),miR-222的靶基因有429个,富集于细胞周期、Fox O信号通路、TGF-β信号通路等69个通路(P0.05);miR-449b和miR-222的靶基因共享的通路为Wnt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路等42个(P0.05)。     

猪微小RNA-15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA-15b(miR-15b)前体（pre-miR-15b）基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变（+58C>T）,本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型（pmR-miR-15bW）和突变型（pmR-miR-15bM）miR-15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR-15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre-miR-15b和miR-15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR-15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR-15b过表达载体（pmR-miR-15bW和pmR-miR-15bM）的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR-15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)（可抑制脂肪细胞分化）以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明：2组细胞miR-15b初级转录本（pri-miR-15b）的表达量没有显著差异（P>0....     

绵羊miR-449a/b前体序列组织表达及生物信息学分析

【目的】探究miR-449a/b在绵羊生长发育和繁殖性能方面的作用,为进一步研究miR-449a/b在绵羊繁殖调控中的作用提供参考。【方法】以湖羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术鉴定miR-449a/b在湖羊下丘脑、垂体和卵巢中的相对表达量。使用TargetScan、miRWalk、miRDB软件预测绵羊miR-449a/b前体序列的靶基因,利用微生信和KOBAS网站对其进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】试验获得的前体序列与NCBI数据库中绵羊前体序列信息比对结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,miR-449a在垂体中的相对表达量显著高于miR-449b(P<0.05),miR-449b在卵巢中的相对表达量极显著高于miR-449a(P<0.01)。利用3个靶基因预测软件做韦恩图分析,取其交集得到miR-449a/b的靶基因数目分别为299和23个。GO功能富集显示,miR-449a/b主要被富集到生物进程;KEGG通路富集结果取前20个通路进行分析发现,主要包括催产素、MAPK等与繁殖调控相关的信号通路。【结论】miR-449a在垂体中的表达量较高,mi...     

牦牛miR-652靶基因预测及生物信息学分析

为进一步探索牦牛miR-652在骨骼肌发育过程中潜在的作用机制,试验从miRbase数据库中下载已有物种的miR-652序列,与牦牛miR-652序列进行比对分析保守性,利用Targetscan软件预测miR-652的靶基因,并与已报道的靶基因合并为靶基因集合;采用g:Profiler和KOBAS 3.0在线软件分别对靶基因集合进行GO注释和KEGG通路富集分析。结果发现:miR-652序列在各物种间高度保守性,靶基因显著富集在细胞命运决定、Notch信号通路的调节、细胞通讯的调节和细胞分化的负调节等生物学过程中;KEGG信号通路富集结果显示,miR-652的靶基因显著富集在一些与骨骼肌发育相关的信号通路中,如Hedgehog、p53、PI3K-AKT、Wnt和Hippo等信号通路。该研究结果初步推测miR-652可能参与牦牛骨骼肌发育的调控,为今后miRNA-652的功能研究和牦牛骨骼肌发育的分子机制的解析奠定了基础。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的初步探讨

主要探讨无卵丘水牛卵母细胞体外成熟的可行性,以便为研究卵母细胞成熟机理提供模型。无卵丘的水牛卵母细胞随机分为5组,然后分别进行直接成熟培养（M1）,与卵丘细胞单层共培养（M2）,用未扩展的卵丘细胞块包围培养（M3）,与扩展的卵丘细胞团共培养（M4）和用卵巢组织包围培养（M5）。无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟培养24 h后检查第一极体（PB1）排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活,评定其成熟质量。结果发现,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其它各组间没有显著差异（P〉0.05）;M5组的孤雌激活卵裂率显著低于M1组和M4组（P〈0.05）,而与M2组和M3组没有显著差异（P〉0.05）,但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组（P〈0.05）。这些研究结果表明：（1）未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟,但与卵丘细胞单层共培养没有作用;（2）卵巢组织包围培养不利于水牛卵母细胞的体外成熟。     

黄芪多糖对种公鸡不同组织miR-16表达的影响及其功能预测分析

本试验研究黄芪多糖(APS)对种公鸡不同组织中miR-16表达的影响,结合miR-16预测靶基因的GO和KEGG功能富集性分析,旨在探讨APS对不同组织功能的潜在调控作用。选取1日龄科宝500父母代肉种鸡64只,随机分为对照组和APS组,每组4个重复,每个重复8只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,APS组在基础饲粮中添加10 g/kg APS,试验期40周。结果表明:1)相比于对照组,APS组可以提高种公鸡的采精量和有效精子数,降低精子畸形率,但差异不显著(P0.05)。2)miR-16具有组织差异性,APS可显著或极显著上调肝脏、脾脏、十二指肠黏膜、回肠黏膜miR-16的表达(P0.05或P0.01),显著降低睾丸miR-16的表达(P0.05)。3)对miR-16预测靶基因进行GO富集分析,表明预测靶基因在跨膜运输、泛素依赖的蛋白质降解、胞内蛋白运输、糖酵解等物质代谢相关生物过程显著或极显著富集(P0.05或P0.01)。KEGG富集分析表明,miR-16靶基因在黏着斑、胰岛素信号通路、糖酵解/糖异生等与机体物质代谢、细胞增殖分化相关通路显著富集(P0.05),在Toll样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等免疫相关通路也有富集。由此可见,APS上调种公鸡脾脏、肝脏、十二指肠黏膜、回肠黏膜组织的miR-16表达,下调睾丸miR-16表达;miR-16预测靶基因与物质代谢、免疫调控密切相关。APS通过调控种公鸡不同组织miR-16表达,影响机体物质代谢和免疫调控功能。     

兔microRNA-18b生物信息学分析及其与CDK19的靶向验证

为探究miR-18b对兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及潜在调控靶点,利用生物信息学技术预测兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能参与的生物学过程。预测结果发现靶基因的功能注释分析显著富集在细胞增殖和凋亡的调控等过程,而其中CDK19可能是miR-18b的潜在靶基因。为验证假设,将扩增的野生型及突变型的CDK19 3'UTR序列分别克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-18b的mimics(试验组)或mimics NC(对照组)共同转染至HEK293T细胞。通过双荧光素酶报告系统检测细胞的荧光素酶活性,鉴定miR-18b与CDK19 3'UTR的靶向关系。并且通过qRT-PCR检测miR-18b对靶基因的调控作用。结果表明:成功构建了CDK19基因3'UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其荧光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b与CDK19表达模式相反。从而证明了miR-18b与CDK19的直接靶向关系,为更深入研究miR-18b与卵巢颗粒细胞的关系奠定基础。     

BMP15-FAT1对猪卵丘细胞凋亡的影响

猪卵丘细胞位于卵母细胞外周,作为一种特殊的颗粒细胞,参与卵母细胞发育、卵泡发育与闭锁以及胚胎的生存和发育等重要生殖生理过程。为探求BMP15通过调控卵丘细胞增殖与凋亡,进而影响卵母细胞生长及成熟的作用机制,本研究通过体外添加BMP15,利用RNA干扰技术、实时荧光定量PCR、流式细胞术等方法,分别检测了添加BMP15后,猪卵丘细胞凋亡情况及凋亡相关通路基因的m RNA表达变化。结果表明:猪BMP15由卵母细胞特异性分泌,可抑制猪卵丘细胞凋亡,同时也可促进FAT1基因的表达;沉默FAT1基因后,BCL2/BAX比率下降,进而影响猪卵丘细胞的凋亡。