水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒（lentivirus）感染水牛颗粒细胞（buffalo granulosa cell,BuGC）、水牛乳腺上皮细胞（buffalo mammary epithelial cell,BuMEC）、水牛成纤维细胞（buffalo fibroblast cell,BuFC）的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数（MOI）。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数（100、200、400、600、800）感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为：BuMEC>BuGC>BuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为：BuGC>BuMEC>BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。     

水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒(lentivirus)感染水牛颗粒细胞(buffalo granulosa cell,BuGC)、水牛乳腺上皮细胞(buffalo mammary epithelial cell,BuMEC)、水牛成纤维细胞(buffalo fibroblast cell,BuFC)的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数(MOI)。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数(100、200、400、600、800)感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为:BuMECBuGCBuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为:BuGCBuMECBuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。     

腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究

试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID_(50)法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数(MOI)值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率(%)。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3～4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10~(11) PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。     

腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究

试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID₅₀法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数（MOI）值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率（%）。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3~4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10¹¹ PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。     

水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析

试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体,且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析,为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因,采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒;利用BLAST程序进行同源性分析,Mega 7.0构建系统进化树,ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装,经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒,将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b,并进行病毒滴度测定;利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞,实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测,对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示,试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列,通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%,与其他物种同源性较高,和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示,pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒,病毒滴度为3.367×10~(10) GFU/mL,感染卵丘细胞后,实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高(P0.01)。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析,发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。     

水牛miRNA-155重组腺病毒载体的构建及生物信息学分析

旨在利用Admax系统构建miRNA-155的腺病毒表达载体,获得含有miR-155的腺病毒颗粒,同时对miR-155的预测靶基因进行生物信息学分析,为研究水牛卵丘细胞中miRNA-155的功能奠定基础。根据GenBank中牛的序列,通过RT-PCR扩增得到pri-miRNA-155序列,并连接到腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP,测序并进行生物信息学分析。将pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155与pBHGloxdelE13cre在HEK-293细胞中包装获得Ad-miRNA-155病毒颗粒,感染水牛卵丘细胞后,利用RT-qPCR技术检测miRNA-155及部分靶基因表达量。TargetScan网站预测获得miRNA-155的靶基因,并利用KOBAS 3.0对预测靶基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明,成功构建腺病毒重组载体pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155,水牛pre-miR-155与黄牛、马、家兔、原鸡、猕猴、狼、树鼩的同源性均达95%以上,且miR-155在进化过程中高度保守。Ad-miR-155感染水牛卵丘细胞后,miR-155的表达水平显著上升(P0.01),预测靶基因Wee1、CD44、TRPS1表达水平显著降低(P0.01)。最后对miR-155预测靶基因进行生物信息学分析发现,miR-155可能通过PI3K-AKT、mTOR及MAPK等信号通路作用于卵丘细胞进而调控水牛卵母细胞体外成熟。     

水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析

试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体，且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析，为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因，采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒；利用BLAST程序进行同源性分析，Mega 7.0构建系统进化树，ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装，经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒，将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b，并进行病毒滴度测定；利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞，实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测，对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示，试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列，通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%，与其他物种同源性较高，和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示，pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒，病毒滴度为3.367×10¹⁰ GFU/mL，感染卵丘细胞后，实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高（P<0.01）。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析，发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。     

影响细胞核移植效率的因素

1997年,世界上第一只成年绵羊乳腺上皮细胞核移植后代多利（Dolly）的诞生。标志着核移植技术进人了一个崭新的发展阶段。这一成就具有划时代的意义。而且进一步证实了基因活性学说的正确性,证明高度分化的体细胞仍然具有基因组的等同性,其细胞核仍然具有支持哺乳动物全程发育的全能性。此后,以不同动物不同组织来源的体细胞进行核移植均得到了后代。这些细胞包括颗粒细胞、卵丘细胞、鼠尾尖细胞、乳腺细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管和子宫上皮细胞、转染或未转染的牛生殖嵴细胞、牛肌肉细胞、牛乳腺上皮细胞、肺组织细胞、兔成纤维细胞等。     

不同转染试剂对慢病毒包装及包装后病毒感染豚鼠成纤维细胞效率的影响

为了研究不同转染试剂对慢病毒载体包装效率及包装后病毒感染细胞的能力,试验利用磷酸钙、脂质体2000、脂质体LTX和Quick Shuttle-293转染编码绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组慢病毒载体进入293T细胞包装病毒,包装的病毒感染豚鼠成纤维细胞,通过流式细胞仪检测转染试剂的转染效率和病毒感染效率,同时利用MTT法检测了4种转染试剂的细胞毒性。结果表明:磷酸钙在转染效率、转染后细胞活力及包装后病毒对豚鼠成纤维细胞的感染效率都最低,分别为(54.8±2.9)%、(26.7±6.0)%和(7.6±1.1)%;脂质体2000和脂质体LTX对293T细胞转染效率差异不显著(P0.05),但脂质体LTX转染后细胞活力显著高于脂质体2000(P0.05),即脂质体LTX的细胞毒性显著低于脂质体2000。而Quick Shuttle-293法转染后的转染效率、转染后细胞活力和其包装后的病毒对靶细胞的感染率分别为(95.5±1.8)%、(88.5±5.7)%和(93.3±1.0)%,都显著高于其他三种转染试剂(P0.05)。说明在本试验条件下,Quick Shuttle-293是一种高效、低毒的慢病毒转染包装试剂,可用于通过病毒载体介导的基因转染技术制备豚鼠诱导多能性干细胞(i PS)。     

腺病毒与慢病毒感染猪原代细胞的比较研究

本实验旨在探究腺病毒和慢病毒侵染猪原代细胞的最佳感染复数(MOI)和侵染时间,确定较优的侵染方式。实验选择体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞、前体脂肪细胞和骨髓间充质干细胞后,分别用腺病毒(MOI=0、50、100、200、500、1 500)和慢病毒(MOI=0、30、50、80、100、300)感染细胞,每隔24 h在荧光显微镜下观察记录细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明:当腺病毒MOI值为500、慢病毒MOI值为80,侵染4 d后,3种细胞荧光强度均较强且细胞形态完好。相比较而言,腺病毒能快速高效侵染猪骨骼肌卫星细胞;而对于猪前体脂肪细胞和猪骨髓间充质干细胞,2种病毒侵染速度相近,但慢病毒的侵染效率和荧光强度更高。因此,对于猪骨骼肌卫星细胞,选取腺病毒作为外源基因载体更为合适;对于猪前体脂肪细胞和猪骨髓间充质干细胞,慢病毒的侵染效果则更好。     

Effect Comparison of Adenovirus Vector Transfer into Different Buffalo Cells

Buffalo mammary epithelial cell,cumulus cell and fibroblasts were transfected by adenovirus vectors and compared their transfection efficiency.293 cells were transfected with pBHGloxdelE13cre and pDC316-eGFP by liposome,the virus was collected and titer was detected.Buffalo mammary epithelial cell,cumulus cell and fibroblasts were exposed to different multiplicity of infection (MOI) of adenovirus vectors.After 72 h,the cells were observed with inverted fluorescence microscope,and transfection efficiency was calculated.When the MOI was 25,50,100,200 and 400,the transfection efficiency of fibroblasts were 0.7%,7.0%,9.0%,12.5% and 34.0%,the transfection efficiency of cumulus cells were 42.5%,55.3%,57.4%,76.0% and 80.0%,the transfection efficiency of mammary epithelial cells were 88.7%,100%,100%,100% and 100%.The results showed that the transfection efficiency of mammary epithelial cell was the best,followed by cumulus cell,and fibroblast was poor.     

山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化

为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。     

Development potential of transgenic somatic cell nuclear transfer embryos according to various factors of donor cell

The present study was conducted to establish an efficient production system for bovine transgenic somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos, the effect of various conditions of donor cells including cell type, size, and passage number on the developmental competence of transgenic SCNT embryos were examined with their expression rates of a marker gene. An expression plasmid for human prourokinase was constructed by inserting a bovine beta-casein promoter, a green fluorescent protein (GFP) marker gene, and a human prourokinase target gene into a pcDNA3 plasmid. Three types of bovine somatic cells including two adult cells (cumulus cells and ear fibroblasts) and fetal fibroblasts were prepared and transfected with the expression plasmid using a liposomal transfection reagent, Fugene6, as a carrier. In Experiment 1, three types of bovine cells were transfected at passages 2 to 4, and then trypsinized and GFP-expressing cells were randomly selected and used for SCNT. Developmental competence and rates of GFP expression in bovine transgenic SCNT embryos reconstructed with cumulus cells were significantly higher than those from fetal and ear fibroblasts. In all cell types used, GFP expression rates of SCNT embryos gradually decreased with the progression of embryo development. In Experiment 2, the effect of passage number of cumulus cells in early (2 to 4) and late (8 to 12) passages was investigated. No significant differences in the development of transgenic SCNT embryos were observed, but significantly higher GFP expression was shown in blastocysts reconstructed with cumulus cells at early passage. In Experiment 3, different sizes of GFP-expressing transfected cumulus cells [large (>30 microm) or small cell (<30 microm)] at passages 2 to 4 were used for SCNT. A significant improvement in embryo development and GFP expression was observed when small cumulus cells were used for SCNT. Taken together, these results demonstrate that (1) adult somatic cells as well as fetal cells could serve as donor cells in transgenic SCNT embryo production and cumulus cells with small size at early passage were the optimal cell type, and (2) transgenic SCNT embryos derived from adult somatic cells have embryonic development potential.     

优化山羊体细胞核移植方案的研究

以乳腺细胞、胎儿成纤维细胞和颗粒细胞为供体细胞进行核移植，比较了供体细胞类型、细胞冷冻及核移植的重建方法（胞质内注射、电融合）对重构胚早期发育的影响。结果：（1）乳腺细胞支持重组胚的发育能力（囊胚率7．14％）显著低于成纤维细胞（16．19％）和颗粒细胞（19．01％）（P〈0．05），卵裂率无显著差异（P〉0．05）；（2）乳腺上皮细胞构建重组胚时电融合法的效率（69．52％）极显著高于胞质注射法（59．20％）（P〈0．01）；成纤维细胞的重组成功率、卵裂率和囊胚率在两种方法间均无显著差异（P〉0．05）；在颗粒细胞，胞质注射法重组成功率（82．17％）显著高于电融合法（50．99％）（P〈0.05），其囊胚率也稍高于电融合法，但无显著差异（P〉0.05）；（3）上述3种供体细胞在冻融后支持重组胚发育力方面无显著差异（P〉0.05）。结论：在山羊体细胞核移植中，上述3种细胞支持重组胚的发育力以成纤维细胞和颗粒细胞较好；细胞冷冻对其无显著影响；在构建重组胚方法上，乳腺细胞以电融合法为宜，颗粒细胞是胞质注射法优于电融合法，而成纤维细胞两种方法均可。