人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

土豆牛奶营养面包的研制

以小麦粉、土豆和牛奶为原料,采用正交试验优化土豆牛奶面包制作工艺。在单因素试验的基础上,以感官品质为考查指标,以土豆、鲜牛奶、白砂糖和酵母粉为正交试验的4个因素,筛选土豆牛奶面包的优良工艺参数。结果表明,土豆牛奶营养面包的优良配方为每100 g面粉用土豆泥30 g,牛奶25 g,白砂糖12 g,酵母粉1 g,鸡蛋10 g,饮用水9 g,面团发酵时间120 min。以此配方生产出的面包营养丰富、感官评分较高,可满足消费者需求。     

全豆豆浆与传统豆浆感官品质和营养成分对比

以大豆为原料,通过感官评定对胶体磨技术自制的全豆豆浆和一般机械磨加工的传统豆浆中的永和豆浆和普通豆浆的感官品质进行了比较,通过营养成分检测对全豆豆浆和永和豆浆的营养成分进行了比较,同时将检测的全豆豆浆营养成分与中国食物成分表中的普通豆浆的营养成分进行比较。结果表明:全豆豆浆口感浓厚,细腻爽滑,豆香味浓郁,无豆腥味,感官评价总得分高于传统豆浆中的永和豆浆和普通豆浆,差异有统计学意义(P0.01);全豆豆浆中蛋白质、脂肪、总膳食纤维、维生素B1、维生素B2、钙、磷脂及大豆异黄酮等营养成分含量均高于永和豆浆,更高于普通豆浆。全豆豆浆的普及不仅可以提高豆浆的营养价值,还可以减少资源的浪费,具有一定的社会和经济效益。     

生乳储运条件对品质影响的探究

菌落总数是衡量生乳品质的重要指标之一。生乳中菌落总数基数越大,其品质越不稳定。但因为奶源产地等原因,生乳必须经过一段时间运输才能到达乳品企业进行生产,运输过程可能由于微生物繁殖导致生乳品质下降。试验选取菌落总数基数不同的两批生乳,通过在2~6 ℃和10~15 ℃条件下存放,模拟生乳在冷藏储运和脱冷储运状态下,分别储存24 h、48 h、72 h、96 h后进行菌落总数、酒精试验、酸度及脂肪酶活力检测。通过对比,找到生乳最佳储存温度和运输时间,为乳品企业和冷链运输提供参考。     

不同蛋白质水平代乳粉对牦犊牛体重及血清生化指标的影响

为探究西藏地区牦牛代乳粉哺育犊牛的适宜蛋白质水平,本试验以藏区高山牦牛为研究对象,研究不同蛋白水平对哺乳期牦犊牛的体重和血清学指标的影响,以筛选出蛋白质水平最佳的代乳粉。选取40头新生当雄县牦犊牛,随机分为4组(n=10):对照组犊牛随母牦牛哺乳(CON),试验组犊牛分别饲喂蛋白水平为21.95%低蛋白组(LP)、24.28%中蛋白组(MP)和26.11%高蛋白组(HP)3种牦牛代乳品。饲喂时间为犊牛30～90d日龄,期间跟踪测定犊牛体重,并分别在30、60和90d日龄采集血清进行分析。结果表明:饲喂3种代乳粉的犊牛体重均显著高于对照组(P0.001),120d日龄时HP组犊牛体重达到最高值;3种代乳粉对犊牛血清抗氧化指标和免疫指标产生一定的影响,其中HP组谷胱甘肽过氧化物酶活性有高于LP组的趋势(0.05P0.1),且HP组丙二醛含量及肿瘤坏死因子a较其他3组低,而免疫球蛋白(IgG、IgM)及谷胱甘肽过氧化物酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性均较其他3组高。综合分析显示在西藏地区蛋白水平为26%的牦牛代乳粉饲喂哺乳期牦犊牛的效果较好。     

巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的生长预测模型构建

巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌污染可能会产生肠毒素,对人体健康造成危害。分别监测在4、10、16、20、24、28 ℃储藏条件下金黄色葡萄球菌在巴氏杀菌乳中的生长数据,采用Modified Gompertz模型、Logistic模型、Huang模型和Baranyi模型构建金黄色葡萄球菌动力学一级模型,采用平方根模型和Arrhenius模型建立二级模型以描述温度与相对最大生长速率(μ_max)的关系。结果显示,各温度下Modified Gompertz模型的拟合度更优,决定系数(R²)>0.98,均方根误差(RMSE)<4.6,为最合适的一级模型。二级模型中,Arrhenius模型的拟合度更优(R²=0.99,RMSE=0.60)。相较于平方根模型,外部验证显示Arrhenius模型的精确度因子(A_f)和偏差因子(B_f)分别为1.39和0.87,较接近于1,说明预测效果更好。研究结果可为巴氏杀菌乳中金黄色葡萄球菌的风险评估提供数据基础,为乳品货架安全期预测提供科学依据。     

猴头菇双层奶工艺和配方的研究

以猴头菇、牛奶、鸡蛋为主要原料研发一款猴头菇双层奶，通过感官评价的方法优化猴头菇双层奶的配方和工艺。结果表明，双层奶上层配方为：牛奶200 g、绵白糖38 g、菠萝汁62.5 g、全蛋液41 g、奶粉5 g、明胶1.2 g；下层配方是：牛奶200 g、菇浆24 g、奶粉2.88 g、绵白糖20 g、蛋清35 g、白醋0.2%；上层与下层质量比为8∶92。加工条件为：下层奶在90 ℃的蒸汽下加热35 min，加入上层奶，蒸20 min。按此工艺和配方制得的双层奶层次清晰，颜色分明，上层暖黄色、有弹性及菠萝芳香，下层纯白色、绵软顺滑、味道清淡。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中五种苯并咪唑类药物

为建立牛奶及奶粉中5种苯并咪唑类药物(阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯达唑、苯硫氨酯)简便、准确的分析检测方法,以固相萃取为净化手段,采用Acquity UPLC^® BEH C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱进行分离,电喷雾离子源(ESI⁺),多反应监测(MRM)模式检测。结果表明,5种苯并咪唑类药物在1~500 μg·L^-1范围内呈线性相关,相关系数(r)均大于0.996,加标平均回收率介于91.7%~97.8%之间,相对标准偏差(RSD)在1.4%~6.5%之间,基质效应均小于15%。5种药物的检出限均在0.1~3 μg·kg^-1范围内,定量限均在0.5~10 μg·kg^-1范围内。该方法操作简单、快速且灵敏度高,重现性好,能够用于牛奶及奶粉5种苯并咪唑类药物的同时测定。