一例猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株与链球菌混合感染的实验室诊断

某规模化自繁自养猪场产房母猪出现流产,保育猪关节肿胀、倒地不起、大量死亡,为研究发病原因,采集流产胎儿、死亡仔猪的肺脏、脾脏、淋巴结和关节液,进行分子生物学检测,病毒和细菌分离鉴定,并检测不同胎龄母猪猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体,结果显示猪繁殖与呼吸综合征病毒检测为阳性,使用PAM分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒,经序列鉴定为高致病性毒株;抗体结果表明四胎及以上母猪猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率异常升高;病料分离的细菌经鉴定为猪链球菌,经实验室诊断确定猪场发病的原因为猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株与猪链球菌混合感染。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株E2基因双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法,根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异,设计了2对特异性引物及1条Taq Man探针,以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒p BS-E2C和p BS-E2作为标准品,建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重Taq Man real-time PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的CSFV双重Taq Man real-time PCR标准曲线Ct值与1×101~1×106copies/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系,灵敏度达10 copies/μL,且特异性和重复性很好。综上,本试验建立的Taq Man real-time PCR检测方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析。     

科技动态

提前感染温和型PEDv可以给猪提供保护力抵抗严重型PEDv根据猪健康监视计划数据,从2013年7月份到2014年7月份,PEDV感染了美国50%左右的猪群。由于目前没有有效疫苗,因此急需一些有交叉保护性的对策。本报实验中我们研究感染温和性PEDV 7个月的母猪所产3日龄仔猪对强毒株的反应。感染温和株与不感染相比仔猪一周存活率分别为100%和67%,发病率分别为43%和100%。7日龄剖检时感染母猪后代肠道PEDV Ct的量为23.6(16.6-30.6),     

猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株VIR基因的比较分析

羊传染性脓疱(Orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的一种人兽共患传染病。VIR是ORFV编码的抗干扰素基因。为比较分析ORFV疫苗弱毒株和野毒株编码的VIR基因的特征,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的VIR基因序列,比较分析了两者核酸水平和氨基酸水平的变异情况以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒VIR基因核苷酸序列相似性为94.6%,氨基酸序列相似性为91.8%,两者在Z-DNA结合结构域和ds-RNA结合结构域均有突变。     

番木瓜环斑病毒弱毒株的构建及分析

弱毒株是利用交叉保护防治植物病毒病害的关键限制因子。通过对马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))。采用定点突变和Gibson拼接法,分别成功构建了4种含有2个突变位点(L_(754)和N_(787))、4个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)和D_(944))、6个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))和8个突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))的PRSV-LM全长c DNA侵染性克隆突变体:p Gprsvm~2、p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8。经人工接种、病症观察和RT-PCR检测,4种突变体克隆均能系统性侵染非转基因番木瓜植株,除克隆p Gprsvm~2的病症表现与亲本强毒株PRSV-LM一致外,其他多位点突变的克隆p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8在番木瓜植株上的病症严重程度出现依次减弱,而克隆p Gprsvm8的病症最弱,且延迟2周发病。本实验初步验证了6个氨基酸突变位点(I_(309)→S、K_(481)→Q、K_(598)→E、F_(753)→L、R_(728)→I和D_(944)→N)与PRSV-LM的病症表现及致病力相关,其中K_(598)→E和R_(728)→I可能是影响致病性的关键位点。     

加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析

【目的】对加州鲈弹状病毒弱毒三水株(MSRV-SS-7)及其母源株(MSRV-SS)进行全基因组克隆和测序分析。【方法】采用分段扩增方法对MSRV-SS-7及MSRV-SS基因组核心序列进行PCR扩增,第1轮根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)基因序列(NC_008514.1)设计10对引物进行扩增并测序;在第1轮扩增产物测序、拼接基础上,设计8对引物进行第2轮扩增,拼接后获得基因组核心序列。同时用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得3′和5′末端序列。采用Vector NTI 8.0对基因组核心序列和末端序列进行拼接,获得基因组全序列,使用Clone Manager 8.0对MSRV-SS-7和MSRV-SS进行序列比对分析;同时使用DNAMAN将基因组G基因序列转换为氨基酸序列,并通过MEGA 5.0与其他鱼类弹状病毒的G蛋白氨基酸序列进行进化树分析。【结果】MSRV-SS-7及其母源株MSRV-SS基因组全长均为11 548 bp,包含N、P、M、G、L等5个结构基因,基因组结构为3′Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5′;MSRV-SS-7与MSRV-SS全基因组中共有10处核苷酸不同。G蛋白进化分析表明,MSRV-SS-7及母源株MSRV-SS与SCRV亲缘关系最近,且与鲈鱼弹状病毒属(Perhabdovirus)聚为一支。【结论】克隆分析了MSRV-SS-7的全基因组序列,可以用于后续活疫苗的开发。