PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）和槟榔坏死环斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus, ANRSV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。VPg（Viral protein genome linked）作为与马铃薯Y病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白,在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通过农杆菌渗透注射接种本生烟（Nicotiana benthamiana）,利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达,且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。进一步采用DAB和NBT染色,在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累。因此,推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子,为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。     

番木瓜环斑病毒弱毒株的构建及分析

弱毒株是利用交叉保护防治植物病毒病害的关键限制因子。通过对马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))。采用定点突变和Gibson拼接法,分别成功构建了4种含有2个突变位点(L_(754)和N_(787))、4个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)和D_(944))、6个突变位点(I_(309)、K_(481)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))和8个突变位点(I_(309)、K_(481)、K_(598)、R_(728)、F_(753)、L_(754)、N_(787)和D_(944))的PRSV-LM全长c DNA侵染性克隆突变体:p Gprsvm~2、p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8。经人工接种、病症观察和RT-PCR检测,4种突变体克隆均能系统性侵染非转基因番木瓜植株,除克隆p Gprsvm~2的病症表现与亲本强毒株PRSV-LM一致外,其他多位点突变的克隆p Gprsvm4、p Gprsvm6和p Gprsvm8在番木瓜植株上的病症严重程度出现依次减弱,而克隆p Gprsvm8的病症最弱,且延迟2周发病。本实验初步验证了6个氨基酸突变位点(I_(309)→S、K_(481)→Q、K_(598)→E、F_(753)→L、R_(728)→I和D_(944)→N)与PRSV-LM的病症表现及致病力相关,其中K_(598)→E和R_(728)→I可能是影响致病性的关键位点。     

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。     

番木瓜实生苗两性株的鉴定及其组培繁殖体系的建立

本研究以多重PCR技术鉴定的番木瓜实生苗两性株茎尖作为外植体,建立和优化了一套组培苗繁殖体系,解决了成龄侧芽来源的无根苗催根难和移栽成活率低的问题。以‘蔬罗’‘蜜红’番木瓜品种的实生苗,通过多重PCR鉴定出两性株,将其茎尖培养于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 6 g/L（pH 5.8）上,在28 ℃、2000 lx条件培养30 d后,继代于MS+BA 0.5 mg/L+KT 0.25 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L（pH 5.8）上,在28 ℃、2000 lx条件下培养30 d形成较为强壮的无根苗,接种于1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂 6g/L（pH 5.8）上进行催根,在28 ℃、1500 lx条件下培养20 d后,用不同浓度营养生根水和不同处理时间对‘蔬罗’‘蜜红’无根苗进行移栽试验,以确定最佳催根率和移栽成活率的浓度和时间。研究结果表明：多重PCR技术鉴定性别的准确率达98%以上,‘蔬罗’在50 mg/L营养生根水和8 h处理条件下获得催根率为81.1%、移栽成活率为91.1%。而‘蜜红’品种则催根率为60%、移栽成活率为86.7%。因此利用这一技术获得的结果相比成龄侧芽优势明显,可用于番木瓜种苗的商业化生产。     

海南地区番木瓜畸形花叶病毒的发现与鉴定

利用马铃薯Y病毒属的简并引物对3个海南感病番木瓜植株的叶片进行RT-PCR检测,并将其克隆到T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：均获得了大小约1 700 bp的特异性条带,与预期大小基本一致;所得序列与GenBank中收录的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）基因序列相似性达到88％～96％,序列包含部分NIb蛋白基因、外壳蛋白（CP）基因和3′端非编码区。这是首次报道在中国海南地区发现番木瓜感染了PLDMV。但是仅基于PLDMV外壳蛋白基因的系统进化分析结果还不足以证明在海南发现的PLDMV与其他地区的某一PLDMV株系为同一进化簇。     

槟榔Catalase基因的克隆及亚细胞定位

过氧化氢酶（Catalase）广泛存在于生物体内,主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H₂O₂,从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害。为了解槟榔过氧化氢酶基因的相关信息,利用植物总RNA提取试剂盒提取槟榔叶片总RNA,通过同源克隆和RACE技术获得槟榔全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明：获得ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN692601）、ArCAT3（MN692602）3个同源基因,其序列全长均为1476 bp,编码492个氨基酸。遗传进化分析显示,ArCATS与同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）等植物的过氧化氢酶氨基酸序列具有较高的相似性,其中与油棕的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,ArCAT1蛋白定位于过氧化物酶体中,而ArCAT2和ArCAT3既定位于过氧化物酶体又定位于细胞核中。这为进一步研究Catalase基因在槟榔中的生物学功能奠定基础。     

甘薯羽状斑驳病毒海南分离物全基因组序列克隆及分析

为了明确海南本地甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)种群的遗传进化关系及致病机理,本研究利用Small RNA测序技术对采自海南的甘薯样品进行鉴定,获得与SPFMV序列具有相似性的85个contigs,与NC_001841相似性较高。试验设计了5对共8条引物,分别为SPFMV-1F/1R、SPFMV-11F/1R、SPFMV-2F/2R、SPFMV-3F/3R和SPFMV-3F/33R PCR,扩增获得3987 bp、3710 bp、1996 bp、3369 bp和4730 bp目的片段。在此基础上再分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增,序列拼接获得SPFMV-HN基因组全序列,其包含完整编码阅读框。本研究结果首次报道SPFMV海南分离物基因组全长,并且在P1区预测到另一个外框元件(pretty interesting sweet potato potyviral ORF,PISPO),聚合酶滑移机制可以产生带有额外核苷酸的转录变体,这些核苷酸可以翻译为P1N-PISPO和P3N-PIPO。本研究结果为进一步探究SPFMV致病分子机理和培育抗病甘薯品种奠定研究基础。     

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性...     

应用Sos恢复系统筛选与番木瓜环斑病毒CI互作的寄主因子

应用Sos恢复系统(Sos recruitment system)筛选可能与番木瓜环斑病毒CI(Cylindrical inclusion protein,圆柱形内含体蛋白)相互作用的寄主蛋白因子,通过营养缺陷、温度敏感筛选、回转验证、序列测定和同源比对分析,获得1种候选的互作寄主蛋白,该蛋白与植物的叶绿体延伸因子Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)具有较高的相似性,并对其在番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus,PRSV)致病与植物防御过程中的功能进行初步分析。     

海南番木瓜环斑病毒全长cDNA克隆及其侵染性克隆构建

为了从分子水平上解析番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）的致病机理,寻找广谱、有效的抗病毒新策略,培育具有应用前景的抗病新品种,利用RT-PCR和快速cDNA末端扩增技术（RACE）对引起番木瓜环斑病毒病的PRSV海南海口分离物（PRSV-HN2）的基因组cDNA进行了全序列测定。PRSV-HN2全长cDNA包含10 326 nt（不包括3′端的polyA,GenBank登录号为KF791028）,能编码3 346个氨基酸。对PRSV-HN2基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了结构和功能分析,结果表明,其与其它23个PRSV分离物的核酸序列相似度达81％~91％,氨基酸相似度为88％~94％。利用酵母同源重组系统成功构建其侵染性克隆载体并通过农杆菌转化与侵染,最终获得其侵染性克隆。这为在分子水平上研究PRSV遗传变异、侵染及致病机理奠定理论基础。