大群体转基因大麦后代快速筛选研究

以携带有潮霉素标记基因的RNAi转基因大麦和常规大麦为材料,采用叶片涂抹法进行了潮霉素筛选浓度确定及转基因大麦T2代和回交后代的筛选和PCR检测。结果表明,3 000mg/L潮霉素连续涂抹3次,5 d后转基因大麦涂抹区域无受害症状,生长受害率显著低于无涂抹处理。潮霉素涂抹检测结果与其PCR检验结果的符合度为96.2%,目的基因筛选准确率可达61.8%。表明所建立的活体幼苗潮霉素叶片涂抹法筛选转基因大麦快速,直观、准确,具有一定可行性。     

地被菊'映洁红菲'再生及遗传转化体系的建立

以地被菊'映洁红菲'试管苗叶片为试材,采用组织培养法,研究了6-苄基腺嘌呤、萘乙酸激素浓度、蔗糖浓度、MS浓度、NO3-和NH+的浓度比、羧苄青霉素浓度及潮霉素浓度对不定芽分化的影响,以期建立'映洁红菲'高效的再生体系,为地被菊转基因体系奠定基础.结果 表明:在6-BA和NAA浓度分别为2.0、0.6 mg·L-1,蔗糖浓度为30 g·L-1,NO3-:NH4+为30∶30,基本培养基3/4MS中,'映洁红菲'叶片中愈伤组织诱导和不定芽分化率达到最高,平均每个叶盘分化3.22个不定芽,诱导率75.67％.在生根培养基中加入浓度为0.75 mg·L-1 IBA时,根系生长最好.'映洁红菲'遗传转化时,羧苄青霉素浓度为250mg· L-1,潮霉素浓度为2.0 mg·L-1,适合作为选择压.     

一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法

    拟南芥活体转基因种子的筛选仍主要采用无菌培养技术,存在操作麻烦,容易污染而造成转基因材料损失等问题.本研究在传统组织培养筛选技术的基础上,通过去除原培养基成分中对种子发芽和筛选不必需的蔗糖和有机成分,降低大量元素的浓度,缩短筛选时间,从而免除了传统转基因种子筛选中培养基和种子消毒的繁琐步骤,建立了一种不依赖于无菌培养的转基因种子筛选方法.与无菌培养筛选比较,筛选效果相同,但简化了试验步骤,提高了筛选操作的可靠性.     

潮霉素对紫花苜蓿愈伤组织诱导和分化的影响

潮霉素是当今基因工程中的一种转化选择剂。通过对苜蓿叶片诱导阶段、分化阶段施加不同浓度的潮霉素,确定潮霉素对紫花苜蓿叶片愈伤组织形成及其分化的影响。研究表明,潮霉素对紫花苜蓿叶片愈伤组织诱导与分化有显著的抑制作用。当潮霉素浓度达到15mg/L时苜蓿叶片完全无法诱导愈伤;愈伤和分化阶段都添加10mg/L潮霉素时,虽然可以诱导出愈伤组织但无法分化。因此建议在遗传转化时诱导愈伤阶段及分化阶段都添加10mg/L潮霉素。     

潮霉素磷酸转移酶的原核表达纯化及其抗体制备

本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。     

潮霉素B预混剂的临床驱虫试验研究

为了解潮霉素B预混剂临床驱除绦虫线虫的有效性和给药时间的合理性,依据兽药临床试验规范,试验选择了蠕虫自然感染皖西麻黄鸡824只,按要求随机分为3组,分别为潮霉素B预混剂治疗组284只,芬苯哒唑粉对照药物组284只,不治疗的感染对照组256只,试验周期根据临床治疗效果确定。结果显示,潮霉素B预混剂,推荐剂量10 mg/kg混饲,连续饲喂21 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为63%和26%,表现明显的驱除蛔虫作用(P0.05),连续饲喂42 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为100%和-13%,驱蛔虫效果极显著(P0.01);对照药物芬苯哒唑粉,50 mg/kg混饲,连续饲喂6 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为100%和44%,同样具有极显著的驱除蛔虫作用(P0.01),本试验中2种药物的驱蛔虫效果相当,对绦虫的驱除作用不明显(P0.05)。潮霉素B预混剂10 mg/kg混饲,连续饲喂42 d,可以驱净鸡蛔虫的感染,但对鸡绦虫感染无明显的驱除作用。     

转Bt基因玉米后代抗虫性快速鉴定技术研究初报

在玉米5～6叶期用1000、1250mg/L卡那霉素和500mg/L潮霉素B进行处理。结果表明,药后4d,不含Bt基因玉米的叶片出现明显的黄斑,而含Bt基因的玉米叶片无症状。田间抗虫鉴定,叶片无症状的玉米表现出不同程度的抗虫性,而叶片出现明显黄斑的玉米则表现出不抗虫。田间抗虫鉴定结果与潮霉素B的鉴定结果t检验未达到显著性差异,说明通过抗生素来鉴定转Bt基因玉米的方法可以在生产上应用。     

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。     

一种快速检测转基因水稻中潮霉素抗性的简易方法

潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphtolransf-erase,hph)基因被证明是一个十分有效的用于植物,尤其是水稻和玉米等禾谷类作物的选择标记基因.由hph基因编码的潮霉素磷酸转移酶可将磷酸基团共价地加到潮霉素B(HygromycinB)的第4位上,从而使受体细胞产生潮霉素抗性(Grita等1983);经潮霉素抗性筛选后,对转化细胞不产生或很少产生毒害作用,再生植株的可育性也较好(Ayres等1994).因此,在大多数有关转基因水稻的研究中,均以该基因作为抗性选择标记.在获得转基因水稻植株后,对其后代植株中潮霉素抗性的检测目前都采用将转化的苗或后代种子接种于含一定潮霉素浓度的选择培养基中,观测小苗生长或种子萌发情况,以判断并筛选抗性植株.     

农杆菌介导法转GM-CSF基因玉米研究初报

利用农杆菌介导法将GM-CSF转化玉米自交系B73、J7-3及杂交种B73×A188幼胚,获得了B73、B73×A188的潮霉素抗性植株,经PCR、PCR-Southern blotting检测,外源基因均已转入玉米基因组中.