潮霉素和PPT对水稻愈伤组织筛选效果的比较

分别以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt基因)和除草剂抗性基因(bar基因)作为筛选标记基因的载体和农杆菌组合转化水稻光温敏核不育系粳稻品种农垦58S和籼稻品种培矮64S，以两个筛选标记基因的相应筛选剂潮霉素(Hyg)和PPT(Basta)对水稻愈伤组织进行筛选研究，初步确定了不同筛选剂对不同水稻愈伤组织的筛选浓度，并比较了两个筛选标记基因的筛选效果．结果表明，不同水稻品种对筛选剂的浓度要求不一样，粳稻品种以Hyg 50mg／L，PPT30mg／L较为适合；籼稻品种以Hyg 50mg／L，PPT 10mg／L，较为适合．PPT(Basta)对粳稻品种农垦58S筛选有效，而对籼稻品种培矮64S来说则易产生假阳性．Hyg作为水稻愈伤组织的筛选剂比PPT(Basta)好．     

雪莲组培过程对潮霉素敏感性的研究

以雪莲叶片为外植体,研究了不同浓度的潮霉素对雪莲愈伤组织诱导、生长及分化的影响,结果表明:8.0 mg/L浓度的潮霉素为雪莲叶盘转化筛选的最佳质量浓度,不同浓度(5 ～50 mg/L)潮霉素对MS+ NAA 2.00 mg/L+ 6-BA 1.00mg/L培养基下雪莲愈伤组织的诱导与生长均有明显的抑制作用,随着潮霉素浓度的升高,毒害程度加深,当潮霉素浓度为20 mg/L时表现为生长的愈伤组织块较小、褐化、甚至死亡.同时,低浓度(0.5 ～2.0 mg/L)的潮霉素可以提高雪莲愈伤组织的分化率,其中0.5 mg/L潮霉素的质量浓度的诱导培养基内,雪莲愈伤组织的出芽率平均可达98.33％.     

芒遗传转化过程中选择压力的确定

以芒(Miscanthus sinensis)胚性愈伤组织为材料,研究了植物遗传转化过程中常用的潮霉素(Hyg)、遗传霉素重硫酸盐(G418)和除草剂(Basta)等3种筛选剂,不同浓度下的不同培养时间对愈伤组织生长、不定芽分化以及再生植株生根的抑制作用。实验结果表明,3种筛选剂均表现出很强的抑制效果。使用75mg/L G418筛选培养20d,50mg/L Hyg筛选20d或20mg/L Basta筛选40d可完全抑制愈伤组织的生长;使用60mg/L G418,40mg/L Hyg或10mg/L Basta筛选培养约20d可完全抑制愈伤组织分化出不定芽;而使用60mg/L G418,50mg/L Hyg或10mg/L Basta筛选培养20d可完全抑制再生植株的生根。3种筛选剂中以Basta对芒植株再生各个阶段的抑制效果最为明显,Hyg的抑制效果次之,G418抑制效果相对不明显。     

潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72 h表达上清LL37蛋白含量约为167 μg /mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06 μg/mL。     

CRISPR/Cas9技术编辑新疆甜瓜全缘叶基因

【目的】以新疆甜瓜地方品种老汉瓜为研究材料,对其全缘叶基因进行基因编辑,构建新疆甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体,分析甜瓜耐受潮霉素最大浓度,为研究新疆甜瓜裂叶基因的功能奠定基础。【方法】在课题组前期确定甜瓜全缘叶基因PLL的基础上,结合甜瓜基因组数据,设计PLL基因外显子的特异靶位点,构建甜瓜全缘叶基因PLL的CRISPR/Cas9敲除载体,将构建好的载体转化到大肠杆菌中,并测序验证,然后对甜瓜耐受潮霉素浓度进行分析。【结果】针对全缘叶基因PLL外显子选择一个长约20 bp的靶位点,根据靶位点设计sgRNA框,并成功将其构建到CRISPR/Cas9敲除载体上,然后将载体成功转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜可耐受潮霉素的最大浓度为10 mg/L。【结论】成功获得甜瓜全缘叶基因PLL的敲除载体,并转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜耐受潮霉素的最大浓度,为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究新疆甜瓜裂叶基因pll的功能奠定基础。     

农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究

以类原球茎体为受体材料,利用农杆菌EHA101(pIG121 Hm)介导转移GUS基因到石斛兰-蝴蝶兰的2个杂交品种。以一种β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择,获得了潮霉素抗性体,并通过X-gluc组织化学染色法,检测到较强的GUS的表达,表达率达80%以上。经过80 d的选择培养后在81个潮霉素抗性组织中获得了22株再生兰花。对其中的9株PCR阳性的再生植株进行Northern分析,检测到较强的GUS基因表达。     

影响农杆菌介导的大豆转化效率的因素研究

本研究运用农杆菌介导的大豆子叶节转化的方法,探讨了包括基因型和抗生素在内的对大豆转基因效率有重要影响的多个因素.研究发现通过侵染4周后丛生芽报告基因表达的检测可以早期评估农杆菌的侵染效率,而侵染4周后丛生芽的出芽率刚能准确地反映大豆的再生能力.通过比较9个大豆品种的再生能力和对农杆菌EHA101的敏感性,得出对该法侵染效果最好的受体品种为黑农37;通过对转基因组培系统中广泛运用的4种抗生素组合的抑菌效果及对转化效率的影响的比较,得出最优的抗生素组合为头孢噻肟(cefotaxime)100 mg/L加羧苄青霉素(carbenicillin)500 mg/L.实验还发现,农杆菌侵染大豆子叶节的最佳侵染时间为30～60min,共培养时间为3～5 d,组培筛选体系选用草丁膦代替潮霉素效果更好.     

根癌农杆菌介导的新暗色柱节孢菌遗传转化

火龙果是一种新兴的热带水果,随着种植面积的不断增大,病害问题日趋严重,其中危害最大的是火龙果溃疡病,导致火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）。为了研究新暗色柱节孢菌的遗传变异与基因功能,必须建立有效的遗传转化体系,但目前国内外未见相关报道。本研究通过构建含有gpdA启动子、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）和潮霉素（Hygromycin）抗性基因为筛选标记的双元表达载体,对新暗色柱节孢菌的孢子进行根癌农杆菌介导的遗传转化,成功获得了阳性转化子。通过荧光显微镜观察表明,阳性转化子菌丝能够产生绿色荧光,野生型菌丝不能产生绿色荧光;PCR检测证明了转化子基因组中整合了潮霉素抗性基因。因此,本研究成功实现了根癌农杆菌介导下绿色荧光蛋白基因在新暗色柱节孢菌中的稳定遗传表达,为研究新暗色柱节孢菌对火龙果溃疡病的致病机制奠定了技术基础。     

抗潮霉素(hygromycin)基因(HPT)向水稻愈伤组织的导入研究

用基因枪（ｐａｒｔｉｃｌｅｇｕｎ）将具有抗潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）基因（ＨＰＴ）的质粒ＤＮＡ（质粒ＰＳＢＧ１０２）导入到水稻品种延农黑１号的胚性愈伤组织中,共处理了２１４个愈伤组织块,用含潮霉素的ＫＳＰ培养基进行选择培养,筛选出６０个在含潮霉素的选择培养基上生长和增殖良好的愈伤组织块,经ＰＣＲ鉴定,确认其中５４个愈伤组织块中导入进了ＨＰＴ基因     

基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶

以双孢蘑菇(Agaricus bisporus)2793为试材,采用基因枪法对其菌褶进行遗传转化,相对转化率为2.69％,转化子经PCR检测表明,外源潮霉素B抗性基因已经被转入到菌丝体中.