间接法Dot－ELISA检测传染性法氏囊病病毒的研究

本文应用间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ进行鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）抗原的检测，其最低检出量为０．４３μｇ／ｍｌ。对人工感染／自然病例的各组织脏器进行检测，结果法氏囊的ＩＢＤＶ检出率为１００％，脾脏的检出率为８０％／８４．９％，其它器官组织如肾、胸腺、心、肝、肺、盲肠扁桃体、胸肌等均含有一定量的病毒（１１～６０％）。经统计学分析，法氏囊与脾脏的病毒检出率之间具有显著性差异（人工感染差异极显著Ｐ＜０．０１，自然病例差异显著Ｐ＜０．０５），进一步证实法氏囊是ＩＢＤＶ最主要的靶器官。试验结果表明，该法检测ＩＢＤＶ抗原，敏感性高、特异性强、重复性好，并且经济、方便、快速，适于大批量样品检测，可作为一种诊断ＩＢＤ的比较理想的方法。     

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的 PCR扩增方法更为简便和快捷     

IBDV地方变异株VP2基因的克隆与特性鉴定

应用 RT- PCR技术对 1株分离于地方免疫鸡群中暴发的传染性法氏囊病病例的传染性法氏囊病病毒 ( infec-tious bursal disease virus,IBDV) HN0 2 6株的 VP2基因进行了克隆与序列分析 ,并与相应毒株的 VP2高变区核苷酸及氨基酸序列进行了比较研究。结果表明 ,HN0 2 6株的核苷酸和氨基酸序列与变异株 Var- A的同源性最高 ,分别达97.3%和 97.6 % ;其次为超强毒株 UK6 6 1 ,分别为 95 .7%和 95 .2 % ;而和弱毒株 PBG98的同源率仅有 92 .8%和90 .3%。其中 ,在第一、二亲水区 ,HN0 2 6株均有 1个氨基酸发生了变化 ,即第 2 2 2位转变为 E、第 31 8位转变为 D。更重要的是 ,其 2 4 9位和 2 5 4位上的氨基酸分别为 K和 S,这些均为变异株的特性。另外 ,HN0 2 6株的七肽区保持SWSASGS不变 ,且第 2 79位和 2 84位氨基酸分别为 D和 A,又完全具备强毒株的特性。因此 ,初步确定所分离的HN0 2 6为有较强致病力的变异株 IBDV。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

共表达NDV F、IBDV VP0基因重组鸡痘病毒中和抗体消长规律

将海兰褐蛋雏鸡随机分为对照组、肌肉注射组、刺种Ⅰ组和刺种Ⅱ组,用共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒进行免疫,对照组刺种生理盐水,在免疫后的第7,14,21,28,35,42,49 d和56 d采血,分离血清,用固定病毒稀释血清法测血清中抗FPV,NDV,IBDV的中和抗体效价.经分析,抗FPV中和抗体效价及抗NDV中和抗体效价免疫后14 d达到高峰,28 d后下降幅度不明显,42 d时仍保持一定水平;抗IBDV中和抗体效价免疫后21 d达到高峰, 28 d后下降幅度不明显,42 d时仍保持一定水平.     

黄芪多糖对人工感染IBDV雏鸡红细胞免疫功能的影响

将由未免疫接种腔上囊病疫苗鸡的种蛋孵化而来的160只1日龄海兰白雏鸡随机分为A、B、C和D共4组。A组为对照组，B、C和D组于26日龄时按每只0．3mL的剂量用IBDV攻毒。A、B组未用黄芪多糖（APS）处理，C、D组从攻毒当日起连续胸肌注射APS6d，剂量分别为每只鸡5mg和10mg。分别在21、29、32、35、38日龄时心脏采血1～3mL，测定E—C3bRR、E—ICRR、ERER和ERIR。结果显示，雏鸡感染IBDV后可使E-C3bRR和ERER显著降低（P〈0．01）；APS处理组E-C3bRR、E-ICRR、ERER均高于A、B组（P〈0．01），其中D组最高，而ERIR则与A组相似。证实，雏鸡感染IBDV后红细胞免疫功能低下，而APS可显著提高其红细胞免疫功能。     

IBDV野毒株的分子生物学鉴定

取3个分离于山东地区几个鸡场IBDV野毒株IBDV SD01、IBDV SD02、IBDV SD03,利用Trizol试剂提取IBDV RNA,设计特定的引物,通过RT-PCR和Nested-PCR,获得分离株的VP2基因高变区的特定序列,并对其进行克隆和序列分析结果表明,分离的3个野毒株在VP2高变区与超强毒株HK46有较高的同源性,关键氨基酸位点都符合超强毒株的特征,与一般的强毒株、变异株和疫苗株的亲缘关系较远。这些关键位点氨基酸的变化使vvIBDV能够逃脱低毒力抗原所产生抗体的捕捉,导致了免疫鸡的发病。     

复方中药对蛋雏鸡感染IBDV后免疫器官的形态学影响

２００只３０日龄健康海兰蛋雏鸡随机分为四组,每组５０只。Ａ组饲料中添加复方中药,接种ＩＢＤＶ;Ｂ组饲料中添加中药,接种ＩＢＤＶ;Ｃ组不添加中药,接种ＩＢＤＶ;Ｄ组不作任何处理为对照组。在接种后７ｄ剖检、取材作石蜡切片,观察鸡免疫器官的形态学变化。结果表明,传染性ＩＢＤ野毒可使鸡免疫器官发育不良,主要导致法氏囊的淋巴细胞变性坏死,抑制免疫活性细胞的生成,导致免疫抑制;中药促进免疫器官发育及免疫活性细胞生成,提高免疫活性,调节免疫抑制,使免疫器官的组织结构保持或恢复正常水平;复方中药抗ＩＢＤＶ感染的效果优于中药。     

传染性法氏囊病病毒抗体检测诊断试剂盒的研制与应用

本文用提纯的ＩＢＤＶ细胞毒为抗原,抗鸡Ｉｇ单抗１Ｂ７ＨＲＰ酶结合物为第二抗体建立了检测ＩＢＤＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ。在此基础上研制出ＩＢＤＶ抗体检测诊断试剂盒。经对１２００份血清进行检测,结果表明：本试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性好,快速稳定,易于操作,为雏鸡ＩＢＤＶ母原抗体和疫苗注射后特异性抗体检测提供了可靠的诊断工具。     

鸡法氏囊、新城疫同胚接种制造弱毒二联苗

鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）和新城疫（ＮＤ）病毒接种同一鸡胚收取种毒试制ＩＢＤ、ＮＤ二联弱毒冻干疫苗,并按《规程》方法分别检验。结果证明安全、效力均能达到合格标准,两种病毒互相不干扰抗体的产生。