猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank报道的N基因高度保守核苷酸序列,设计并合成一对引物。上下游引物与Gen Bank中登录的153株猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板,利用SYBR Green I荧光染料法进行RT-PCR扩增,获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照,建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验,变异系数0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证,核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确等优点,可用于临床PEDV的检测及分子流行病学调查。     

猪链球菌2型四川分离株猪体回归试验

选用35~38日龄的健康断奶仔猪21头,分3组,用2005四川分离株SSsc0501分别经静脉、肌肉注射和口服3种途径感染,进行猪体回归试验。肌肉注射组(含菌0.6×108个/mL)16 h开始出现症状,至36 h全部死亡,发病率、病死率均为100%;静脉注射组(含菌0.2×108个/mL)25 h开始出现症状,48 h内全部死亡,发病率和病死率均为100%;口服攻毒组(含菌2×108个/mL)90 h后开始有发病症状,第9天有1头死亡,发病率75%,病死率33%。从感染病死猪的肝脏、脾脏、肾脏、心血、大脑、脑脊液、淋巴结、肺脏和关节液中均分离到链球菌,经鉴定为试验攻毒的目的菌,表明猪体能够很好地用于猪链球菌2型动物感染模型,同时说明该菌侵害器官广泛,为进一步探讨该病的综合防制提供了重要技术依据。     

鹅源新城疫病毒F基因的克隆及其序列分析

鹅新城疫是近年来我国新发现的能感染多种禽类的传染病，国内许多学者在该病的发生、发展规律以及分子病毒学等领域有了较多的研究，现已确定该病毒是禽副粘病毒Ⅰ型即新城疫病毒的一个变种。本实验选择最近分离的2株鹅源新城疫病毒，采用已经发表的鸡新城疫病毒序列设计引物，应用RT—PCR技术扩增鹅源新城疫病毒的F基因，并将其克隆至载体上，然后进行了核苷酸序列测定、进行了系统的分析，并根据遗传距离的远近确定了鹅源新城疫病毒在NDV系统发育进化树中的地位。     

新城疫疫苗对SPF鸡和商业肉鸡的免疫学效力分析

将不同新城疫病毒疫苗免疫SPF鸡和商业用肉鸡,对免疫后抗体水平变化和对野毒株攻击的保护率进行了监测。利用Clone30、F48E8和NXF3单联苗和联苗免疫过的SPF和商业肉鸡,对105EID50两次攻毒保护率均为100%;而只用LaSota疫苗免疫的SPF鸡保护率为40%。试验数据表明,分离株NXF3具有较好的免疫原性和对强毒攻击的保护,可以作为候选疫苗用于商业肉鸡。     

五种核酸提取试剂盒对新城疫病毒RNA提取效率的比较

本研究采用罗氏、天隆、赛默飞世尔等公司生产的5种核酸提取试剂盒,对新城疫病毒RNA的提取效率进行比较,以优选出提取效率高、耗时短、成本低的核酸提取方法,为各级实验室开展新城疫病毒核酸检测提供技术参考。采用5种商品化核酸提取试剂盒,对不同浓度(稀释度10~0~10~(-8)/EID50 10~(8.3))的新城疫病毒标准样品进行RNA提取,通过实时定量荧光RT-PCR进行检测,以Ct值评价5种试剂盒的RNA提取效率,并对试剂盒的RNA提取时间和价格等进行综合比较分析。结果显示:High Pure Viral RNA Kit(罗氏)、动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒(天隆)和Lab Serv Viral Total NA Kit(赛默飞世尔)的RNA提取效率较高。其中,Lab Serv Viral Total NA Kit对低浓度样本的RNA提取效率最高,价格最便宜;Tian Long的RNA提取所需时间也较短,但操作最为简便。综合提取效率、时间及成本等因素,分析认为Lab Serv Viral Total NA Kit(赛默飞世尔)性价比最高,适用于大批量临床样品的集中检测。     

4株新出现的Ⅰ类新城疫病毒F基因的变异分析

为了分析我国新出现的Ⅰ类新城疫病毒的分布和分子特性,对2016年分离到的4株Ⅰ类新城疫病毒进行F基因序列分析和遗传进化分析。结果显示:4株Ⅰ类新城疫病毒F基因编码长度均为1 662nt,共编码553个氨基酸,分离株之间氨基酸相似性为97.9%~100%。4株分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112 ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株的分子特征。F基因高变区(47—420nt)遗传进化分析结果显示这4株病毒为国内新出现的基因型,利用F基因编码区全长序列构建系统进化树显示4株病毒属于基因1c亚型,与北美分离株高度同源,而与国内基因1c亚型分离株(Duck/Guangxi/1261/2015)相似性仅为95.5%~97%。监测数据表明这种新出现的Ⅰ类新城疫病毒具有在国内进一步流行和扩散的风险。     

鹅源新城疫病毒感染鹅的组织学变化研究

自1997年以来,在江苏省苏南、苏北许多地方的鹅群中流行一种以消化道呈糠麸样并有溃疡、胰腺肿胀且表面有灰白色点状坏死灶为特征的具有高度发病率和死亡率的鹅病。目前此病在山东、福建、安徽、浙江、上海、四川、吉林、江苏等全国大部分地区大面积流行,     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

对从健康家鸭中分离到的一株Class I新城疫病毒分离株Duck/China/08-004/2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段,并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E-Q-Q-E-R-L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低(分别为55.4%和57.7%)。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于ClassI,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota(Class II中的基因II型)和V4(Class II中的基因I型)处在不同的进化分支。通过构建57株ClassI新城疫病毒的遗传进化树,表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似,同属于基因3型。     

一株基因VII型新城疫病毒的分离与鉴定

应用一步法RT-PCR技术成功扩增了一株自然分离NDVF基因的重要功能区片段(约500bp)。最后测序结果表明:该分离株F0裂解位点氨基酸序列为NDV强毒株特征性序列(112-R-R-Q-K-R-F117),且具有NDV基因VII型的特征性氨基酸,即101位的K和121位的V。     

加快牧区发展建设小康社会

1 牧区小康建设内涵,牧区小康至少包括以下几个方面的内容。