四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物（油菜、大豆、花生和芝麻）中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域（BOX I-IV）和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1, Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜BnActin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高（接近大豆GlymaActin的2%）,Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。       

甘蓝型油菜分枝数QTL定位及其候选基因预测

分枝数是影响油菜产量的重要株型性状之一。为了有助于油菜分枝数的分子标记辅助育种,以甘蓝型油菜品系888-5(多分枝)和M083(少分枝)杂交形成的重组自交系(RIL)群体为材料,通过利用第一张油菜60KSNP芯片对群体进行高通量SNP分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对RIL群体在4个环境(武汉-2012、武汉-2013、扬州-2012和扬州-2013)下分枝数进行QTL定位。结果表明:共检测出18个分枝数QTL,分布于A2、A6、A7、C1和C4连锁群。其中11个QTL在2个以上环境下可重复检测到;有2个QTL与环境之间存在互作效应。主效QTL 2个(qBN2-3和qBNE2-1),分别在3个、4个环境下重复检测到,可解释的表型变异为13.12%~20.60%,2.80%~30.10%。qBNE2-1与环境存在互作效应。另外,通过利用SNP标记侧翼序列和油菜基因组比对作图,从3个QTL(qBN2-1、qBN7-6和q BN7-8,三者可解释的表型变异分别为19.40%~17.30%、5.70%~12.21%和7.88%~10.32%)的基因组区段内(分别为279kb、165kb和562kb)共筛选出4个与分枝数有关的候选基因,它们的拟南芥同源基因(分别为CUC2、PIN3、F23N20.8和PIN4)均参与拟南芥分枝数的分化或形态建成。     

甘蓝型油菜类甜蛋白激酶BnTLK1与真菌病害抗性相关

类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）是病程相关蛋白第5家族蛋白，在部分物种中发现有的TLP蛋白C端融合了激酶结构域。为探讨该类融合基因在植物与病原菌互作中的作用，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜中鉴定到一个N端具有TLP结构域，C端为富含丝氨酸苏氨酸受体类激酶结构域的基因（BnTLK1）并成功克隆该基因。序列分析表明BnTLK1第254至276个氨基酸具有典型的跨膜结构，三级结构形成两个明显独立的TLP和激酶结构域。转录组数据显示，该基因在多个组织中表达丰度较低，此外，相比于菌核病感病品种Westar，高抗品种ZY821中其表达丰度较高，且核盘菌诱导后表达明显上调，表明该基因可能参与油菜抗菌核病过程。为了验证BnTLK1对核盘菌等真菌的影响，通过原核表达系统成功表达BnTLK1蛋白，在0.4 mmol/L IPTG和17℃低温条件下诱导培养，最终获得BnTLK1可溶性蛋白，抑菌实验发现BnTLK1能够抑制核盘菌和灰霉菌丝的生长。     

甘蓝型油菜株高性状的全基因组关联分析

适当的株高不仅是抗倒性和机械化收获的需要,而且是建立高产理想株型的需要。本研究测定来自世界油菜主产国的371份种质资源材料构成的自然群体的株高,利用60K SNP芯片对该群体进行基因型检测,获得了21 856个SNP,利用这些SNP和株高数据进行全基因组关联分析,结果表明:(1)检测到4个与株高显著关联的SNP,即Bn-A07-p3583161、Bn-scaff_22790_1-p1271170、Bn-scaff_20735_1-p42779和Bn-scaff_18702_1-p589589,分别分布于A07、C01和C02染色体;它们对表型变异的解释率分别为11.33%、11.75%、12.31%和10.97%;(2)参考基因组信息,在上述前3个SNP附近的492.0、9.5和69.5 kb处分别找到一个与株高性状相关的候选基因;(3)4个显著SNP各自的等位基因间表型均值差异分别为11.09、15.12、10.48和8.93 cm,双尾t测验结果表明各等位基因组间差异显著。     

甘蓝型油菜BnTLP1基因的菌核病抗性研究

前期发现甘蓝型油菜类甜蛋白基因BnTLP1在菌核病抗性品种中的表达丰度高,为探究和解析其作用机制,通过叶片接种核盘菌,对拟南芥BnTLP1过表达转基因株系、野生型对照和突变体tlp1-1之间的抗菌核病效果进行分析。结果表明：过表达BnTLP1拟南芥的病斑面积显著小于野生型对照,而tlp1-1病斑扩展大于对照,即BnTLP1正调控菌核病抗性。亚细胞定位表明BnTLP1定位于细胞膜和细胞核,暗示其不仅在细胞膜发挥抑菌功能,而且在核内行使其它功能。不同防御反应信号通路的标志基因表达分析表明,茉莉酸/乙烯途径可能在早期参与了BnTLP1介导的菌核病抗性。     

基于高深度重测序的春性、半冬性和冬性甘蓝型油菜基因组遗传变异分析

为研究不同生态适应型甘蓝型油菜之间的遗传变异,采用高通量测序手段对春性、冬性和半冬性甘蓝型油菜代表性品种（奥罗、Darmor-Bzh和中双11号）进行了高深度重测序。通过遗传变异比较分析,在春性和冬性、春性和半冬性、冬性和半冬性之间检测到丰富的遗传变异,包括SNP、Indel、结构变异和拷贝数变异等。三个不同生态型甘蓝型油菜之间存在遗传变异分布的基因数目分别为43 983、44 592和44 991个。对这些基因进行GO富集分析,发现它们主要富集在基础代谢、生长发育调控和环境适应性等相关的GO类别中。针对不同生态型之间的差异特点,重点关注开花时间的调控网络,发现与植物春化途径、赤霉素途径、衰老途径等相关的重要基因FCL、VRN、GA、SPL3等同源拷贝中均存在遗传变异,推测这些基因功能可能与甘蓝型油菜不同生态适应性的形成相关。本研究在不同生态适应型品种内检测到的大量的遗传变异以及这些变异在基因中的分布为解释甘蓝型油菜不同生态适应型的形成提供了遗传基础,为后续的分子育种以及改良生态适应性提供理论指导。     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶基因BnCP51及其启动子的克隆与表达

为通过转基因技术建立新型授粉控制体系,克隆与雄性不育相关的基因及启动子,根据甘蓝型油菜全基因组信息设计特异引物,获得半胱氨酸蛋白酶家族基因Bn CP51的完整开放阅读框和上游启动子序列。Bn CP51基因全长1 032bp,在Gen Bank登录号KC898325,启动子长1 951bp。生物信息学分析表明,Bn CP51具有木瓜蛋白酶基因家族典型的保守结构域ERFNIN和GCNGG功能域。实时荧光定量PCR结果表明Bn CP51在花蕾中高量表达。在线启动子序列元件预测分析发现Bn CP51启动子序列中有多个花药特异表达元件。构建重组载体p Bn CP51::GUS,转化拟南芥,GUS染色结果表明在Bn CP51启动子的驱动下,报告基因GUS仅在中期花蕾和花药中特异表达,在其他组织中不表达。