拟南芥抗菌核病突变体的筛选

为筛选模式植物拟南芥抗菌核病基因源，建立了两种抗性鉴定筛选方法：菌丝体直接接种离体叶法和菌核病毒素草酸-病菌接种两步法。后者是先用2 mmol/L草酸在MS培养基上筛选，存活的植株经PCR验证，阳性植株移栽培养15 d 后，再用菌丝体接种鉴定。采用第一种方法筛选了5 000株突变体，发现了抗感差异明显的个体；采用第二种方法筛选了46 600株，发现2株对菌核病高抗的功能缺失型突变体。野生型对照在接种后12h即出现病斑，而突变体在36h才出现，其病斑大小仅为对照的六分之一。     

甘蓝型油菜Bn19070的表达与同源基因At2G19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bn19070与拟南芥At2G19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2G19070入手,利用amiRNAi (人工微RNA干扰)技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90%以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2G19070基因的干扰对Bn19070的功能研究有借鉴作用。     

大豆灰斑病菌菌丝块离体叶接种快速鉴定方法的建立

[目的]建立一种室内可重复、快速准确鉴定大豆对灰斑病抗性的方法。[方法]利用大豆灰斑病1号和7号生理小种及6种不同抗性的大豆品种为材料,研究并建立了大豆灰斑病抗性的菌丝块接种快速鉴定方法。[结果]在28℃、12h光照与12h黑暗交替的条件下,Minimal培养基生长的菌丝块接种抗感大豆叶片,菌斑面积明显不同,且鉴定结果与已知抗感品种报道的灰斑病抗性一致。[结论]菌丝块离体叶接种鉴定具有不受生育期和环境条件限制、可重复性强的特点,是大豆灰斑病抗性室内鉴定的一种有效方法。     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan-GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料,采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白,对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明,采用理想的蛋白质裂解液（7 mol/L 尿素,2 mol/ L 硫脲,4% CHAPS（3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐）,65mmol二硫苏糖醇,0.5% IPG缓冲液 pH 3~10或pH 4~7,全蛋白酶抑制片剂 (片／10 ml)）裂解蛋白,以150μg上样,按IEF程序Ⅱ(30V,12Hr;200V,1Hr;500V,1Hr;1000V,0.5Hr;10000V,2Hr;10000V,80000VHr)进行等电聚焦,10%SDS-PAGE胶浓度进行第二向电泳,银染方法检测,可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。     

四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物（油菜、大豆、花生和芝麻）中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域（BOX I-IV）和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1, Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜BnActin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高（接近大豆GlymaActin的2%）,Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。       

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明：与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

甘蓝型油菜MAP激酶4的序列及其诱导表达分析

拟南芥MPK4（AtMPK4）在病害抗性中具有重要作用。本文克隆和分析了油菜MPK4（BnMPK4）的cDNA及其氨基酸序列和诱导表达变化。推导的氨基酸序列含有T201E202Y203磷酸化位点和CD锚定区域,与AtMPK4的序列相似性为95%。用化学物质苯丙噻重氮、甲基茉莉酸、草酸以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnMPK4在各诱导或处理后的表达量。结果表明,苯丙噻重氮快速诱导该基因的表达,甲基茉莉酸抑制其表达;草酸和核盘菌均快速诱导该基因上调表达,并且二者的上调表达趋势相似。结果表明油菜MPK4可能在油菜菌核病防卫反应中起作用。     

甘蓝型油菜分枝数QTL定位及其候选基因预测

分枝数是影响油菜产量的重要株型性状之一。为了有助于油菜分枝数的分子标记辅助育种,以甘蓝型油菜品系888-5(多分枝)和M083(少分枝)杂交形成的重组自交系(RIL)群体为材料,通过利用第一张油菜60KSNP芯片对群体进行高通量SNP分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对RIL群体在4个环境(武汉-2012、武汉-2013、扬州-2012和扬州-2013)下分枝数进行QTL定位。结果表明:共检测出18个分枝数QTL,分布于A2、A6、A7、C1和C4连锁群。其中11个QTL在2个以上环境下可重复检测到;有2个QTL与环境之间存在互作效应。主效QTL 2个(qBN2-3和qBNE2-1),分别在3个、4个环境下重复检测到,可解释的表型变异为13.12%~20.60%,2.80%~30.10%。qBNE2-1与环境存在互作效应。另外,通过利用SNP标记侧翼序列和油菜基因组比对作图,从3个QTL(qBN2-1、qBN7-6和q BN7-8,三者可解释的表型变异分别为19.40%~17.30%、5.70%~12.21%和7.88%~10.32%)的基因组区段内(分别为279kb、165kb和562kb)共筛选出4个与分枝数有关的候选基因,它们的拟南芥同源基因(分别为CUC2、PIN3、F23N20.8和PIN4)均参与拟南芥分枝数的分化或形态建成。     

油菜防卫素和草酸氧化酶基因的克隆与诱导表达水平研究

基于拟南芥、甘蓝及油菜等的植物防卫素(PDF)相关基因序列和已克隆的油菜草酸氧化酶(OXO)基因序列设计PCR引物,对甘蓝型油菜基因组DNA进行扩增,获得了序列大小分别为470bp和629bp的PDF1.2和OXO.生物信息学分析表明,该PDF1.2和GenBank中的相关基因同源性在42%～71%,OXO和GenBank中的相关基因同源性在70%以上.在油菜苗期,油菜黑胫病病原接种后基因PDF1.2表达量增加3倍以上,基因OXO也有不同程度的增强表达;诱导剂acibenzolar-s-methyl诱导基因OXO增强表达,但不能诱导PDF1.2增强表达.诱导的系统表达(非处理叶)高于局部表达(处理叶).这是首次报道油菜PDF1.2克隆和诱导表达结果.     

芝麻EST-SSR引物的开发与应用

为丰富芝麻EST-SSR引物,本研究从实验室构建的高油芝麻品系中芝14号的不同种子发育期cDNA文库中获得45 569条表达序列标签（expressed sequence tags,EST）,通过前处理得到总长17.428Mb的无冗余EST共32 421条。利用MISA和SSR finder软件包工具对EST序列进行SSR位点查找,在这些序列中发现有1 688条Unigene,共有1 949个SSR。共226个序列含2个或2个以上SSR位点。这些SSR中出现频率最高的重复基序类型为三核苷酸(74%)。为开发芝麻EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于芝麻品种遗传差异研究的可行性,用12份不同含油量品系材料评价其中34对与油脂代谢相关的基因SSR引物,全部成功扩增,共有3对引物获得多态性条带。结果表明,芝麻EST-SSR 标记开发效率较高,是芝麻SSR标记开发的重要措施,对于芝麻品种的鉴定与遗传多样性分析具有很高的应用价值。