大豆Glyma.05G222700.2基因生物信息学与逆境表达分析

为研究Glyma.05G222700.2基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在抗非生物胁迫过程的功能和原理,促进大豆抗逆候选基因的开发利用,本研究通过生物信息学方法对大豆Glyma.05G222700.2基因进行同源序列、蛋白结构、进化树和转录组分析,通过qRT-PCR分析盐胁迫下大豆不同组织中该基因的表达情况。结果表明:该基因编码区长2 040 bp,编码697个氨基酸,预测分子量为656.54 kD,pI8.026。多序列比对发现Glyma.05G222700.2蛋白包含1个Pkinase结构域。进化树分析表明该蛋白与野大豆、刺毛黧豆、赤豆一致性较高。转录组数据表明Glyma.05G222700.2基因在大豆各组织中均有表达,其中在种子中表达量最高,在根中表达量最低。qRT-PCR结果发现Glyma.05G222700.2基因在毛状根、茎、叶中均有表达,在茎中表达量最高,在叶中表达量最低;在毛状根中盐胁迫12 h表达量达到极值,盐胁迫24 h表达量下降;在茎中表达量呈上升趋势,在24 h表达量达到极值;在叶中表达量不稳定,盐胁迫2 h该基因不表达,盐胁迫6 h该基因表达量达到极值并高于对照,盐胁迫12和24 h表达量低于对照。推断该基因可能在大豆抵抗盐胁迫过程中起到重要作用。     

大豆Glyma.18G261700基因生物学分析及功能初探

MYB是参与花青素合成的重要调控基因，数量众多且功能多样。为分析大豆中与花生黑色种皮调控基因AhTc1(MYB家族)同源基因的功能，本研究根据AhTc1基因序列信息，同源克隆大豆MYB家族基因Glyma.18G261700,对其进行生物信息学分析，并检测不同种皮颜色大豆苗期不同部位花青素和基因表达量。结果显示：Glyma.18G261700全长1 572 bp,编码189个氨基酸，属于R2R3型MYB。AhTc1编码的蛋白为疏水性蛋白，而Glyma.18G261700与之不同，编码的蛋白为亲水性蛋白。三级结构中Glyma.18G261700与AhTc1尾部有所区别，在调控种皮颜色中可能具有不同功能。不同种皮颜色大豆幼苗根部花青素含量较低，而Glyma.18G261700基因的表达量较高，表明在大豆幼苗期该基因的大量表达可能抑制根部花青素的合成，但对种皮颜色的调控还需进一步探索。     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

大豆Glyma04G227700生物信息学分析及与Glyma08G11030互作研究

咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)是一种催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化酶。前期研究表明，大豆抵御干旱胁迫的F-box基因Glyma08G11030编码蛋白可能与COMT蛋白Glyma04G227700发生互作，为了预测分析大豆COMT基因Glyma04G227700的功能及二者的互作关系，本研究克隆Glyma04G227700基因，并对其进行生物信息学分析，通过实时荧光定量检测方法分析其在大豆不同组织中的表达情况，并利用酵母双杂交系统验证蛋白互作情况。结果显示：Glyma04G227700基因全长1 095 bp,编码366个氨基酸，与野大豆(RZC17879.1 Glycine soja)亲缘关系较近。Glyma04G227700在大豆的根、茎、叶、子叶中都有表达，且在根和茎中表达量较高，在子叶中表达量最低。酵母双杂结果表明Glyma08G11030与Glyma04G227700蛋白不存在互作。     

大豆病程相关蛋白PR-5及其同源蛋白TPLs的生物信息学分析

大豆病程相关蛋白PR-5又称为类甜蛋白TLPs,广泛分布于高等植物体内,各种生物和非生物胁迫诱导(病原微生物、渗透胁迫,机械损伤和植物激素等)均可诱导其表达。本研究以PR-5编码基因Glyma01g42670.1为目的基因,对该基因及其同源蛋白的结构和功能进行了分析;通过生物信息学的方法,共筛选获得42条大豆TLPs蛋白质序列,并用Mega 4.1软件构建其系统进化树;同时对Soy Base中的大豆TLPs相关的表达数据进行分析。结果表明:大豆病程相关蛋白PR-5的编码基因Glyma01g42670.1编码240个氨基酸的多肽链,p I 6.26,是一种酸性蛋白,属于疏水蛋白,该蛋白质具有典型的TLP家族的保守结构域,具有指导PR-5蛋白的跨膜转移(定位)的N端信号肽序列,PR-5蛋白不含有跨膜螺旋结构,主要存在于质外体中,属于分泌蛋白,推测该蛋白具有内切葡聚糖酶的催化活性,进化分析表明:该编码基因与拟南芥的NP_192902.1基因属于直系同源基因,它们是具有相同功能和共同起源的基因,组织表达特异性分析表明该基因主要在根部和花中表达。     

基于共线性分析的大豆种子硬实性QTL定位及候选基因预测

大豆种子硬实度关乎食品与饲料加工。为提高大豆种子硬实度分子标记辅助选择的效率，发现相关候选基因，利用染色体片段代换系（chromosome segment substitution lines, CSSL）对大豆种子硬实性进行了两年的QTL定位研究，结合前人得到的25个种子硬实性QTL，利用MCScanX对整个大豆基因组进行分析，生成共线性区组，评估大豆种子硬实性QTL之间的共线性，确定了位于Gm02片段的中心QTL。利用多个数据库分析hub-QTL区段的基因，锚定了8个与大豆种子硬实性相关的候选基因。从CSSL群体中选择种子硬实性不同的两个品系和轮回亲本，用于随后的实时荧光定量PCR分析，发现候选基因Glyma.02G269400和Glyma.02G269500在CSSL群体中硬实性不同的2个品系及轮回亲本绥农14中的表达差异显著。Glyma.02G262600在绥农14中的相对表达量约是CSSL-136的5倍，而在CSSL-200中表达量中等，推测该基因抑制大豆种皮的形成。     

大豆GmIDD及其同源基因的生物信息学分析及功能预测

利用NCBI和Phytozome数据库进行GmIDD基因的同源基因检索,获取该基因在大豆不同染色体中5个拷贝的序列信息。通过对功能结构域的分析结果显示GmIDD基因5个拷贝均含有2个C2H2型(72~92 aa、114~142 aa)、2个C2HC型(149~169 aa、176~195 aa)锌指结构域。GmIDD基因cDNA序列全长为1 227 bp,编码408个氨基酸。系统进化树分析结果显示GmIDD基因5个拷贝中除了Glyma.14g10940和Glyma.17G228000外,其它IDD蛋白间进化距离较远,表明不同大豆IDD基因在功能上可能存在一定差异。长短日照处理下GmIDD表达量的分析结果显示GmIDD基因受短日照诱导表达,因此推测GmIDD可能参与大豆开花的调控过程。     

大豆耐胁迫相关蛋白编码基因GmSAMDC1的克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosine methionine decarboxylase,SAMDC)是亚精胺和精胺合成的关键酶,更是多胺生物合成的限速酶之一,在植物耐胁迫反应中发挥重要调控作用。为研究大豆SAMDC编码基因的结构和表达特性,本研究从抗病大豆品种科丰1号中克隆了位于大豆基因组2号染色体上的GmSAMDC1(Glyma. 02G128000)基因,分析结果表明:其完整ORF长度为1 068 bp,编码一个由355个氨基酸组成的包含1个SAM_decarbox结构域的蛋白; GmSAMDC1基因所编码蛋白的理论等电点为4. 86,相对分子质量为38 987. 13 Da,为亲水性蛋白,不含跨膜区;大豆中共有8个GmSAMDC1的同源基因,GmSAMDC1与红车轴草(PNY09439. 1,82. 64%)和拟南芥(At SAMDC3,67. 22%)中的SAMDC蛋白编码基因亲缘关系最近; GmSAMDC1启动子序列包含防卫和胁迫响应元件、植物激素应答元件、光应答元件等许多顺式作用元件; GmSAMDC1在花中的表达量最高,与其大豆同源基因Glyma. 01G071300(序列相似性为94. 6%)、Glyma. 18G278800(66. 8%)和Glyma. 08G25580(66. 5%)的组织特异性表达模式比较相似; Glyma. 02G128000-GFP融合蛋白在细胞膜和细胞质上表达。本研究结果为进一步阐明大豆GmSAMDC1基因在大豆耐胁迫过程中的作用提供了理论依据。     

大豆PPR基因家族生物信息学分析

为明确大豆PPR基因家族在染色体上的分布、保守结构域、亚族种类、进化关系及表达特征等,采用生物信息学方法,基于Pfam的PPR种子序列模型筛选大豆基因组数据库,获得631个大豆PPR家族基因;利用MEME、ExPASy、TBtools、FigTree等工具对大豆PPR家族基因进行分类,分析各亚族的进化关系和保守结构域差异;筛选各亚族的代表基因,并进一步分析各亚族基因的保守率、等电点、UTR、CDS及基因表达特异性.结果表明:大豆PPR基因家族分为DYW、P、PLS、E/E+亚族以及1个未知亚族,其中DYW亚族为第一大亚族,占总基因数目的57.2％;各亚族基因在染色体上的分布是不均匀的,其内含子数目差异也较大,DYW亚族基因的内含子数目较少,但DYW亚族结构域种类最多,具有在C端出现特有的Motif7和Motif4的显著特征;但大豆PPR家族的各亚族基因表达特异性比较相似,均表现为叶片中高表达,花、根和茎中低表达;而且各亚族中都有大量成员缺失UTR;Glyma.19G095500、Glyma.11G086900、Glyma.02G175900和Glyma.01G158100这4个基因具有独特的Motif8保守结构域,为新的亚族.     

花生鞘脂Δ8去饱和酶基因(AhSLD2)的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到了1个AhSLD基因,命名为AhSLD2,该基因开放阅读框(ORF)为1347bp,编码448个氨基酸。AhSLD2蛋白与拟南芥AtSLD的相似性为73%,都具有b5保守结构域和3个组氨酸保守域结构,属于SLD蛋白家族。利用荧光定量PCR对AhSLD2基因在花生中的表达特性进行分析,结果显示AhSLD2主要在茎中表达,并且在种子发育初期表达量最高,AhSLD2基因对干旱和ABA胁迫最敏感,在根中的表达量分别上调了21倍和14倍,推测其可能主要参与花生对干旱胁迫的适应性调节。研究为花生抗逆品种改良提供了新的基因资源。     

青枯雷尔氏菌在不同作物根际定殖与轮作防病

青枯病是芝麻和花生的重要病害之一。为探索合理的轮作防控模式，运用青枯雷尔氏菌（Ralstonia sola⁃ nacearum）抗利福平标记菌株JXS02-L土壤接种，测定菌株在芝麻、花生、甘薯、大豆、玉米和小葱等6种作物根际土 壤和根部的定殖与消长动态，分析了不同轮作模式对芝麻/花生青枯病发生程度的影响。结果表明：播种后3w，6种 作物根际土壤菌量均低于初始接种菌量；播种后6 w，芝麻、花生、甘薯根际土壤菌量已上升至初始接种菌量水平 （3.20 ×106~4.93×106 CFU·g-1），之后菌量持续上升，大豆、玉米根际土壤菌量则持续下降；播种后12 w，大豆、玉米根 际土壤菌量比芝麻、花生、甘薯根际土壤菌量低4个数量级，小葱植种后6 w~12 w，均未检测到病菌。播种后3 w~ 12 w，芝麻、花生和甘薯根部菌量持续上升，大豆和玉米根部菌量先升后降；至播种后12w，大豆和玉米根部菌量比 芝麻、花生和甘薯根部菌量低5个数量级，小葱根部则始终未检测到病菌。芝麻-大豆-小葱-芝麻、芝麻-大豆-玉 米-芝麻2种轮作模式芝麻青枯病病情指数比芝麻-花生-甘薯-芝麻轮作模式分别降低19.95%、12.87%；花生-大 豆-玉米-花生轮作模式花生青枯病病株率比花生-芝麻-甘薯-花生轮作模式降低11.63%。本研究结果对于了解 青枯雷尔氏菌的生态多样性，以及指导青枯病的科学防控具有重要意义。     

大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量PCR分析中内参基因的筛选

以高抗和高感HG 0大豆胞囊线虫的野生大豆种质为试验材料,采用q RT-PCR技术检测了ACT11(Glyma.18G290800)、Tubulin-motif(Glyma.19G194800)等24个候选持家基因在不同大豆胞囊线虫侵染时期(接种后9,15和20 d)野生大豆根系中的基因表达情况,除Actin(Glyma.08G182200)出现了非特异扩增外,其它23个持家基因的q RT-PCR扩增效果均理想,扩增特异性高。分析上述23个持家基因的表达丰度,并利用Best Keeper、ge Norm和Normfinder对其表达稳定性进行评价。结果表明:持家基因间的表达丰度不尽相同,而且有些持家基因在不同品种间或不同处理间(接种虫卵和接种水)也存在表达丰度的差异。23个持家基因的表达稳定性也不相同,综合来看,表达最不稳定的基因为Cons9(Glyma.10G152200)、Cons2(Glyma.17G138500)、Cons1(Glyma.15G270900)和Tubulin-motif(Glyma.20G136000),本试验条件下它们不适宜作内参基因;其余持家基因相对稳定,本试验条件下可选择Tubulinmotif(Glyma.15G132200),Cons6/SKIP16(Glyma.12G051100)或Tubulin-motif(Glyma.05G110200)作为内参基因,它们表达量较高,表达最为稳定,其Ct平均值分别为25.7、26.5和25.0,标准偏差分别为0.540、0.575和0.490,ge Norm软件评价其稳定性的M值分别为0.698、0.715和0.727。该研究为野生大豆抗胞囊线虫相关基因的表达分析提供了参考。     

Molecular cloning and expression analysis of the Rf-m candidate genes encoding pentatricopeptide repeat proteins in soybean

Cytoplasmic male sterility (CMS)-restorer system is a useful tool to exploit heterosis in soybean. The major restorer gene for the M-type CMS is known as Rf-m, located in the 162.4-kb region on chromosome 16. Sequence analysis has revealed that the Rf-m locus in Glycine max consists of seven pentatricopeptide repeat (GmPPR) genes. The deduced amino acid sequences contain 8 to 14 PPR motifs, and a phylogenetic analysis grouped these GmPPR proteins into two PPR subfamilies: Glyma.16G161800 belongs to the PLS subfamily, and the P subfamily consists of Glyma.16G161900, Glyma.16G162000, Glyma.16G162100, Glyma.16G162700, Glyma.16G162800, and Glyma.16G163100. The phylogenetic analysis of seven GmPPR proteins and 27 other plant PPR proteins also showed that proteins in the same subfamilies cluster together. Comparative sequence analysis was conducted using the seven Rf-m candidate GmPPR genes from the sterile line W931A, the maintainer line W931B, and the restorer line WR016, the result showed that Glyma.16G161900 had higher polymorphism than the other candidate genes. Based on real-time quantitative RT-PCR data, all seven GmPPR genes were differentially expressed but showed constitutive expression in roots, stems, leaves, and pollen grains. Additionally, the expression level of Glyma.16G161900 in the sterile line W931A was significantly higher in all tissues than in the restorer line WR016. Taken together, these results suggest that Glyma.16G161900 is the most likely candidate for the restorer gene Rf-m. This study is the first report and analysis of candidate fertility restorer (Rf) genes encoding PPR proteins in soybean.     

大豆F-box基因Glyma08g11030启动子克隆及植物表达载体构建

本研究以大豆Williams 82的基因组DNA为原始材料,根据前期预测的Glyma08g11030启动子序列用DNAMAN8.0设计引物,通过常规PCR方法克隆获得了Glyma08g11030基因上游长度为3 000 bp的启动子序列。在PlantCARE植物启动子区域在线预测网站上查询,预测的结果显示Glyma08g11030启动子序列里含有数量众多、功能各异的顺式作用元件。其中以TATA-box和CAAT-box这两个基本的顺式作用元件最多,此外还有许多与应答相关的顺式作用元件,如干旱、热、光、激素等。根据这些顺式作用元件在Glyma08g11030启动子序列中的位置对启动子序列进行截短并分别设计引物,采用PCR方法成功截出了3段长度分别为2 492,1 185和342bp的启动子序列,将3段序列替换pCAMBIA3301载体双酶切出的CaMV35S启动子序列,并构建了3个启动子序列驱动GUS植物融合表达载体,从而得到含不同顺式作用元件的启动子序列。研究结果将为以后分析Glyma08g11030启动子的功能和作用机理提供前期准备。     

大豆耐盐相关基因研究进展

大豆（Glycine max（L.）Merill）是植物蛋白质和油脂的重要来源。盐胁迫是造成大豆产量损失的主要非 生物胁迫因素。耐盐基因的挖掘对培育大豆耐盐品种至关重要。本文一方面总结了通过正向遗传学获得的大豆 耐盐相关数量性状位点或基因，如萌发期耐盐性主效基因GmCDF1（Glyma.08g102000）、2个出苗期QTL（分别位于6 号和14号染色体）；苗期耐盐性主效基因GmSALT3（Glyma03g32900）以及位于G连锁群的QTL。随着对大豆耐盐性 研究的不断深入，目前认为大豆萌发期、出苗期、苗期的耐盐性无直接相关性。另一方面总结了通过反向遗传学途 径获得的参与离子运输、转录调控等耐盐性基因，以及通过生物工程技术转入外源基因提高大豆耐盐性的研究进 展，期望为解析大豆耐盐分子机制和耐盐育种提供参考。     

大豆脯氨酸生物合成相关基因Glyma01g24530的功能预测及表达分析

干旱胁迫下的脯氨酸积累在许多植物中都存在,人们普遍认为脯氨酸含量的提高促进了植物对干旱胁迫的抵抗能力。拟南芥中研究发现,△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS1是一种限速酶用来催化脯氨酸生物合成,对脯氨酸非常重要。本研究通过生物信息学及荧光定量PCR对大豆中的P5CS1同源基因Glyma01g24530进行了初步的功能分析和表达模式验证。结果发现:Glyma01g24530具有保守的N端乙酰谷氨酸合成酶激酶结构域和N端乙酰谷氨酸合成酶激酶结构域,系统进化树显示与各植物中P5CS家族成员相似性很高,启动子顺式作用元件序列分析表明该基因存在逆境胁迫、光反应等元件。表达模式分析显示Glyma01g24530可以被干旱、盐诱导表达,并在多数组织中表达。     

基于大豆导入系群体结瘤相关性状QTL定位及基因挖掘

氮元素是植物生长所需的重要营养元素之一,生物固氮是大豆生长所需氮元素的重要来源。本实验室以绥农14为母本,野生豆ZYD00006为父本构建一套覆盖野生大豆全基因组的导入系群体。基于大豆导入系群体对结瘤数目和干重进行QTL定位,定位到3个QTL与根瘤干重相关,分布在N、M和D2这3个连锁群上,定位到5个QTL与根瘤数相关,分布在K、F、J和D2这4个连锁群上,在D2连锁群这两个性状有重叠区段(7.20-7.79Mb)。针对这个重叠区段的63个基因进行基因注释,选择到6个与共生、抗病相关的基因作为候选基因进行下一步验证。qRT-PCR分析表明根瘤菌侵染期间Glyma.17G097000基因表达模式与对照相比差异很大。Glyma.17G097000属于GmHIR基因家族,在大豆基因组中发现了11个家族成员。GmHIR家族基因结构相似性很高,基因表达有组织特异性。大豆HIR蛋白有Stomatins和Prohibitin两个结构域,能够参与离子通道调节等生理过程,与植物抗病和细胞周期有关。GmHIR基因来源于四个祖先,进化过程中是高度保守的。对GmHIR基因家族11个成员qRT-PCR检测,结果显示根瘤菌感染期间Glyma.05G029800、Glyma.09G154400和Glyma.17G097000这三个基因与对照相比表达模式差异较大。结果表明这三个基因可能在大豆共生体系建立中起着重要的作用,参与根瘤菌与大豆共生体系建立过程中的离子通道调节和免疫反应。本研究为大豆-根瘤菌共生机制研究奠定基础并提供有效候选基因。     

大豆黄绿叶突变体NJ9903-5性状表现与基因定位研究

叶色突变体既可用于作物叶绿素合成、降解和光合作用等研究,也可作为标记基因为作物育种利用。本文对一个新发现的大豆黄绿叶自发突变体NJ9903-5进行遗传鉴定。结果表明:从对生真叶开始,该突变体幼嫩叶呈黄色,随着生长叶片逐渐转变为绿色。黄化叶片叶绿体数目下降,基质片层减少且排列疏松,叶绿素a、b、类胡萝卜素含量都极显著下降;其对株高、主茎节数、单株粒数、单株荚数有负效应,但对百粒重、蛋白质含量、油脂含量影响小,杂交后代中上述性状变异大。3个杂交群体遗传分析表明该性状受一对隐性核基因控制,利用F2隐性个体将目标基因ygl定位在SSR标记BARCSOYSSR_02_1445和BARCSOYSSR_02_1477之间约366 kb区段,包含36个候选基因。测序分析发现在突变体中,叶绿体膜转运蛋白相关基因Glyma.02G233700第1个外显子第38个碱基G缺失,移码突变导致蛋白翻译提前终止,结合前人研究结果,推测其为黄绿叶的目的基因ygl。     

转录组测序筛选野生大豆糖代谢途径干旱相关基因及其表达差异分析

野生大豆较栽培大豆有更广的遗传多样性，在组学水平整体分析其基因表达模式对筛选抗旱关键基因、 解析干旱胁迫响应调控网络和促进分子育种具有重要意义。本研究采用高通量测序技术对PEG6000模拟干旱胁 迫处理第0 h、6 h、12 h、24 h和48 h的30d苗龄野生大豆RNA进行转录组测序，获得了1796条糖代谢途径相关序 列。淀粉和蔗糖代谢途径通路注释的差异基因最多，半乳糖代谢途径次之；在获得的109个差异表达基因中，干旱 胁迫处理第12 h差异表达基因最多；对以上109个差异表达基因构建蛋白质相互作用网络，以节点度>10为标准筛 选中心节点，共获得8个关键基因。为进一步研究野生大豆干旱胁迫下的糖代谢相关基因奠定了基础。