芝麻发芽期耐盐性鉴定方法研究及耐盐候选基因的挖掘

【目的】确定芝麻发芽期耐盐性鉴定适宜的NaCl胁迫浓度和评价指标,发掘耐盐种质和耐盐相关重要基因,为芝麻耐盐性大规模鉴定、遗传改良和耐盐机理研究提供方法借鉴和优异基因资源。【方法】以8份耐盐性差异较大的芝麻种质为材料,在不同浓度的NaCl（0、50、100、150、200和250 mmol·L^-1）胁迫下发芽,测定其发芽势、成苗率、根长、芽长和鲜重等指标,通过对指标值的方差分析、主成分分析、隶属函数和相关性分析等,筛选芝麻发芽期耐盐性鉴定适宜的NaCl处理浓度和评价指标。以100 mmol·L^-1 NaCl溶液为处理浓度,相对成苗率为鉴定指标对71份芝麻核心种质进行发芽期耐盐性鉴定和全基因组关联分析,并对获得的候选基因进行功能注释;通过NaCl胁迫下芝麻幼苗叶片转录组测序和荧光定量PCR分析候选基因的表达模式,筛选耐盐相关候选基因。【结果】对不同浓度NaCl胁迫下8份芝麻材料发芽各指标进行统计和方差分析表明,100 mmol·L^-1的NaCl处理下,除发芽势外,发芽指数、活力指数、成苗率、根长、芽长和苗鲜重的标准偏差值均较大,所有指标在0.05水平上均存在显著差异,100 mmol·L^-1的 NaCl溶液可以作为芝麻发芽期耐盐性鉴定的适宜胁迫浓度;相对成苗率、相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数、相对芽长、相对根长和相对鲜重7个指标与芝麻发芽期耐盐性关系密切,贡献率较高,可以作为芝麻发芽期耐盐性鉴定的评价指标。71份芝麻核心种质材料的相对成苗率变异比较丰富,符合正态分布;通过对71份芝麻核心种质相对成苗率与SNP标记进行全基因组关联分析,检测到7个与芝麻发芽期耐盐性显著关联的SNP标记（LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301）,SNP标记上、下游各100 kb区间内共有基因67个,其中有功能注释的基因34个;通过耐盐材料S04在盐胁迫下的转录组测序和荧光定量PCR对预测的候选基因进行表达模式分析,共有21个候选基因受到盐胁迫诱导显著差异表达。【结论】芝麻发芽期耐盐性鉴定的适宜NaCl胁迫浓度为100 mmol·L^-1,相对成苗率等7个指标可以作为适宜的评价指标;检测到与芝麻发芽期耐盐性显著关联的SNP标记7个,并鉴定出耐盐候选基因21个。     

芝麻赤霉素合成相关基因鉴定与表达分析

赤霉素的生物合成是多种酶促反应的过程,与植物植株发育、逆境响应密切相关。为分析芝麻基因组中赤霉素合成相关基因的分布、结构和活性特征,本研究以芝麻基因组序列和不同组织转录组为对象,通过生物信息学方法,从中共鉴定出32个赤霉素合成相关基因,分属7个不同的基因家族,分布在除5号染色体外芝麻所有的染色体上。不同基因家族蛋白质肽链长度存在较大差异,其中CPS家族的蛋白质序列最长,平均包含776个氨基酸残基;KAO家族蛋白序列长度的变异最大,在401-834个氨基酸之间。所有芝麻赤霉素合成相关基因编码的蛋白质预测为亲水性蛋白。与拟南芥、水稻、大豆、葡萄、高粱、番茄等物种相比,芝麻中赤霉素合成相关基因数目处于中等水平,但CPS家族中芝麻的基因数目明显多于其他物种,进化分析表明,在分析的7个物种中,芝麻与番茄具有较近的进化关系。在不同组织中,7个相关基因家族表达模式不同。KS家族基因在种子、茎尖和叶片中表达相对较高;CPS家族基因在心皮和种子中活性较强,但在茎尖和叶片中几乎没有表达;KAO和KO家族基因在不同组织中整体上具有相对较高的活性,而KS、GA3ox家族的基因在不同组织中整体表达量较低。就不同组织而言,种子中的GA合成相关基因活性整体较高;而在根尖、茎尖、叶片等与芝麻植株形态建成密切相关的3个组织中,这些基因表达以根尖较突出、其次为茎尖,在叶片中的活性整体较低。本研究为解析芝麻赤霉素合成相关基因的结构特征及其在不同组织中的作用特点提供了基因信息和理论参考。      

四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物（油菜、大豆、花生和芝麻）中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域（BOX I-IV）和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1, Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜BnActin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高（接近大豆GlymaActin的2%）,Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。       

甘蓝型油菜分枝数QTL定位及其候选基因预测

分枝数是影响油菜产量的重要株型性状之一。为了有助于油菜分枝数的分子标记辅助育种,以甘蓝型油菜品系888-5(多分枝)和M083(少分枝)杂交形成的重组自交系(RIL)群体为材料,通过利用第一张油菜60KSNP芯片对群体进行高通量SNP分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对RIL群体在4个环境(武汉-2012、武汉-2013、扬州-2012和扬州-2013)下分枝数进行QTL定位。结果表明:共检测出18个分枝数QTL,分布于A2、A6、A7、C1和C4连锁群。其中11个QTL在2个以上环境下可重复检测到;有2个QTL与环境之间存在互作效应。主效QTL 2个(qBN2-3和qBNE2-1),分别在3个、4个环境下重复检测到,可解释的表型变异为13.12%~20.60%,2.80%~30.10%。qBNE2-1与环境存在互作效应。另外,通过利用SNP标记侧翼序列和油菜基因组比对作图,从3个QTL(qBN2-1、qBN7-6和q BN7-8,三者可解释的表型变异分别为19.40%~17.30%、5.70%~12.21%和7.88%~10.32%)的基因组区段内(分别为279kb、165kb和562kb)共筛选出4个与分枝数有关的候选基因,它们的拟南芥同源基因(分别为CUC2、PIN3、F23N20.8和PIN4)均参与拟南芥分枝数的分化或形态建成。     

芝麻EST-SSR引物的开发与应用

为丰富芝麻EST-SSR引物,本研究从实验室构建的高油芝麻品系中芝14号的不同种子发育期cDNA文库中获得45 569条表达序列标签（expressed sequence tags,EST）,通过前处理得到总长17.428Mb的无冗余EST共32 421条。利用MISA和SSR finder软件包工具对EST序列进行SSR位点查找,在这些序列中发现有1 688条Unigene,共有1 949个SSR。共226个序列含2个或2个以上SSR位点。这些SSR中出现频率最高的重复基序类型为三核苷酸(74%)。为开发芝麻EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于芝麻品种遗传差异研究的可行性,用12份不同含油量品系材料评价其中34对与油脂代谢相关的基因SSR引物,全部成功扩增,共有3对引物获得多态性条带。结果表明,芝麻EST-SSR 标记开发效率较高,是芝麻SSR标记开发的重要措施,对于芝麻品种的鉴定与遗传多样性分析具有很高的应用价值。       

甘蓝型油菜株高性状的全基因组关联分析

适当的株高不仅是抗倒性和机械化收获的需要,而且是建立高产理想株型的需要。本研究测定来自世界油菜主产国的371份种质资源材料构成的自然群体的株高,利用60K SNP芯片对该群体进行基因型检测,获得了21 856个SNP,利用这些SNP和株高数据进行全基因组关联分析,结果表明:(1)检测到4个与株高显著关联的SNP,即Bn-A07-p3583161、Bn-scaff_22790_1-p1271170、Bn-scaff_20735_1-p42779和Bn-scaff_18702_1-p589589,分别分布于A07、C01和C02染色体;它们对表型变异的解释率分别为11.33%、11.75%、12.31%和10.97%;(2)参考基因组信息,在上述前3个SNP附近的492.0、9.5和69.5 kb处分别找到一个与株高性状相关的候选基因;(3)4个显著SNP各自的等位基因间表型均值差异分别为11.09、15.12、10.48和8.93 cm,双尾t测验结果表明各等位基因组间差异显著。     

芝麻种质资源信息数据库的设计与构建

农作物种质资源信息的数据建设对品种改良至关重要。本研究对我国收集保存的8 115份芝麻种质资源的基本信息、形态特征和生物学特性、品质特性、抗性等数据进行规范整理,以90 420条芝麻信息为数据来源,采用LMAP数据库技术构建了在线芝麻种质资源信息数据库http://www.sesame-bioinfo.org/phenotype/index.html。数据库主要功能包括芝麻种质资源信息浏览、信息检索及实物索取。本数据库的创建打破了传统纸质或综合性数据库存储芝麻种质资源信息的局限,有效解决芝麻种质资源数据保存分散,共享、交流、利用困难等问题,实现了芝麻资源数字化管理和交流,将极大促进资源的有效利用。     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶基因BnCP51及其启动子的克隆与表达

为通过转基因技术建立新型授粉控制体系,克隆与雄性不育相关的基因及启动子,根据甘蓝型油菜全基因组信息设计特异引物,获得半胱氨酸蛋白酶家族基因Bn CP51的完整开放阅读框和上游启动子序列。Bn CP51基因全长1 032bp,在Gen Bank登录号KC898325,启动子长1 951bp。生物信息学分析表明,Bn CP51具有木瓜蛋白酶基因家族典型的保守结构域ERFNIN和GCNGG功能域。实时荧光定量PCR结果表明Bn CP51在花蕾中高量表达。在线启动子序列元件预测分析发现Bn CP51启动子序列中有多个花药特异表达元件。构建重组载体p Bn CP51::GUS,转化拟南芥,GUS染色结果表明在Bn CP51启动子的驱动下,报告基因GUS仅在中期花蕾和花药中特异表达,在其他组织中不表达。