拟南芥抗菌核病突变体的筛选

为筛选模式植物拟南芥抗菌核病基因源，建立了两种抗性鉴定筛选方法：菌丝体直接接种离体叶法和菌核病毒素草酸-病菌接种两步法。后者是先用2 mmol/L草酸在MS培养基上筛选，存活的植株经PCR验证，阳性植株移栽培养15 d 后，再用菌丝体接种鉴定。采用第一种方法筛选了5 000株突变体，发现了抗感差异明显的个体；采用第二种方法筛选了46 600株，发现2株对菌核病高抗的功能缺失型突变体。野生型对照在接种后12h即出现病斑，而突变体在36h才出现，其病斑大小仅为对照的六分之一。     

核盘菌Ss160的基因克隆与功能初探

由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是油菜等十字花科作物的重要病害，对油菜的产量品质造成严重影响。本研究基于转录组数据筛选到一个核盘菌基因Ss160 (Sscle04g035160)，发现Ss160在接种油菜的核盘菌中高度表达。生物信息分析表明该基因具有信号肽，且序列在真菌界高度保守。亚细胞定位显示Ss160无特异性的定位，烟草叶片瞬时表达Ss160在核盘菌离体叶接种实验中病斑扩展显著小于表达空载体的和野生型烟草叶片，暗示异源表达Ss160能够提高植物的菌核病抗性。基于酵母系统的体外实验证明Ss160具有转录激活能力。该研究结果为后续Ss160在核盘菌-植物互作中功能机制的研究提供基础，也为油菜菌核病的研究提供借鉴和参考。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA(amiRNA)干扰载体(该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因)转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强(P0.05)。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

大豆MYB转录因子GmMYB010与其拟南芥同源基因的功能差异

MYB-related转录因子在植物生长发育和响应逆境胁迫过程中具有重要作用。本研究旨在分析大豆MYB转录因子GmMYB010与其在拟南芥中的同源基因AtMYB010的功能差异。序列分析表明,大豆的GmMYB010与拟南芥中AtMYB010都属于MYB-related转录因子家族中R-R-type类型;亚细胞定位结果表明两种蛋白均定位在核上;qRT-PCR检测结果表明,GmMYB010在大豆叶片中表达量最高,而AtMYB010在花中表达量最高;酵母检测发现,GmMYB010具有转录自激活活性,而AtMYB010不具有转录自激活活性。将GmMYB010与其拟南芥同源基因AtMYB010分别在野生型拟南芥中过量表达,表型观察发现GmMYB010过表达植株表型与野生型拟南芥一样,而AtMYB010过表达植株出现了矮小、多分枝等生长表型。对MAXs作用途径基因的检测发现,AtMYB010过量表达影响了独脚金内酯代谢途径,从而出现多分枝的表型。以上结果表明,GmMYB010和AtMYB010虽然是直系同源基因,但功能却发生了明显的分化。大豆GmMYB010在大豆中可能具有独特的功能,有待进一步研究。     

萝卜抗菌肽基因Rs对菌核病的抗性

为分析萝卜抗菌肽Rs是否对核盘菌具有抗性,人工合成了Rs基因,并利用水稻α-淀粉酶信号肽αAmy3SP引导目的基因在胞间隙和质体表达的作用特点,通过基因重组技术构建植物表达载体p35S-SP-Rs,同时构建了p35S-SP-GFP载体,基因枪轰击洋葱表皮。实验发现荧光信号主要存在于植物细胞的细胞壁和细胞膜之间,说明在35S和信号肽αAmy3SP的引导下GFP在细胞间隙中有效表达。采用浸花法将植物表达载体p35SSP-Rs转入拟南芥中,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得35株Rs转基因阳性植株。qRT-PCR显示Rs基因在转基因拟南芥中的表达水平得到显著提高,而植株的生长发育未受影响。抗病鉴定结果显示,转基因植株对菌核病的抗性显著增强。结果说明通过在细胞间隙中高量表达抗菌肽Rs,在避免对细胞产生毒性的同时,显著抑制了核盘菌菌丝的扩展,从而达到抗病目的。     

水稻抗稻瘟病突变体lmm326的鉴定与调控通路初步分析

【目的】绝大多数水稻类病斑突变体中免疫系统被激活可以有效提升其对稻瘟病的抗性,为进一步解析类病斑突变体抗病的分子机制,对类病斑突变体lmm326进行了研究。【方法】lmm326是粳稻中花11通过EMS辐射诱变,经多代自交和回交获得的一个类病斑突变体,并将突变体分别与中花11和Dular杂交获得的F_2群体用于遗传分析,采用图位克隆的方法对目的基因进行精细定位。【结果】5叶期时,该突变体下部叶片表面开始出现类病斑表型;与野生型相比,突变体叶片光合色素含量、净光合速率、株高、结实率、单株有效分蘖数、千粒重等显著下降;突变体带病斑叶片中死亡细胞数量及过氧化氢的积累量明显多于野生型;突变体相较于野生型对4个已鉴定的稻瘟病生理小种的抗性明显提高。遗传分析表明该性状由一对单隐性核基因控制。采用图位克隆方法将该基因定位在第1染色体长臂端38kb的区间内,其中包含6个开放阅读框。测序发现基因Os01g0919900第2外显子上对应CDS的第433位碱基由C突变成T,最终导致其编码蛋白的第145个氨基酸由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,lmm326中参与水杨酸信号通路的防卫基因显著上调表达。【结论】LMM326与OsSSI2互为等位基因,该基因可能参与负调控水杨酸信号转导途径,其突变激活了水稻体内的防卫反应。     

hrpZ_(Psta)在转基因大豆中定量表达与疫霉根腐病和灰斑病抗性相关研究

以T5转hrpZPsta基因大豆JN29-705-15和JL30-187为材料,利用实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real Time PCR,qRT-PCR)检测了目标基因在转基因大豆不同组织中的表达量,分别利用下胚轴侵染法和叶面喷施法鉴定疫霉根腐病抗性和灰斑病抗性,并分析目的基因表达量与疫霉根腐病和灰斑病抗性的相关性。结果表明:hrpZPsta基因在大豆的叶、茎、根、籽粒中均有表达,二个株系平均相对表达量分别为8.2/6.1、0.9/0.7、6.5/4.6和0.8/0.7;T5转hrpZPsta基因大豆抗疫霉根腐病和灰斑病能力与野生型相比均有所提高,JN29-705-15对疫霉根腐病抗性从感病提高到中抗,而JL30-187从中抗提高到抗病;hrpZPsta基因在叶中的表达量也与抗灰斑病能力呈正相关,与病情级别呈极显著负相关。试验结果初步证明了外源基因hrp ZPsta在大豆植株中的表达量与受体植株对疫霉根腐病和灰斑病抗性存在一定的相关性。     

OsDUF500基因沉默提高水稻对白叶枯病的抗性

 以编码HarpinXoo 的hrf1转基因水稻NJH12的cDNA为模板,克隆到了DUF500的保守功能区。序列分析表明,OsDUF500是DUF500家族成员,功能未知。构建OsDUF500的沉默载体,用土壤根癌农杆菌介导的方法转化粳稻 R109,用Hpt抗生素做抗性筛选,获得9个再生株系。经分子鉴定,8个为沉默株系（ABD 2~9）。与野生型相比, ABD株系株高变矮,叶片变短,出现白色空秕谷。白叶枯病抗性鉴定结果表明,OsDUF500沉默株系对水稻白叶枯病的抗性存在差异,病斑长度比野生型明显缩短,病斑面积均在30%以下,株系ABD 3和ABD 5病斑面积分别为12.3%和15.7%,显示出较好的抗性。推测在稻瘟病抗性中上调表达基因OsDUF500对水稻白叶枯病抗性起负调控作用。     

拟南芥AtTrx5增强植物菌核病的抗性研究

核盘菌是危害十字花科作物生产的重要病原菌。核盘菌诱导寄主产生过量活性氧（ROS），造成寄主细胞死亡，硫氧还蛋白（Trx）在寄主抗氧化过程中起重要作用。筛选并鉴定硫氧还蛋白（Trx），分析其与核盘菌抗性的关系，将为植物抗菌核病育种提供基因资源。本研究通过生物信息学及转录组数据分析，从拟南芥中筛选到一个关键Trx基因AtTrx5。AtTrx5与甘蓝型油菜BnaA08g04320D的亲缘关系最近，氨基酸相似性为85%。油菜同源基因Trx5表现出上调表达。AtTrx5超表达植株在接种核盘菌24 h后的菌斑面积相比野生型（WT）减小30%～39%，而AtTrx5基因T-DNA突变体的菌斑面积比WT增加39.2%。在侵染过程中超表达转基因拟南芥中AtTrx5的表达量均高于WT，而T-DNA突变体中AtTrx5的表达量则低于WT。DAB染色、H2O2含量、·O2-含量测定结果表明，侵染过程中拟南芥T-DNA突变体中积累的ROS高于WT，超表达转基因拟南芥中积累的ROS少于WT。     

油菜菌核病及抗病育种研究进展

综述了油菜菌核病的生物学特性及各种生态因子对其生长发育的影响,从油菜菌核病的发病原因、侵染过程及侵染方式,菌核菌致病机理及油菜抗菌核病机理等方面,介绍了油菜菌核病的抗性遗传及抗菌核病的育种研究进展情况.     

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF(乙烯相应转录因子)保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白(PR)防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

油菜与核盘菌互作分子机理研究进展

菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary）引起的真菌性病害,每年导致油菜（Brassica napus L.）产量损失10%-20%,是制约我国油菜生产最主要的病害。培育抗（耐）病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。本文主要综述了近五年油菜-核盘菌互作分子机制的研究进展。研究表明：（1）核盘菌侵染寄主早期存在活体营养型阶段;（2）草酸提供的酸性pH,而非草酸本身,是核盘菌的必需致病因子;（3）核盘菌有效地利用效应蛋白抑制寄主的抗病反应或者诱导寄主细胞坏死以帮助其侵染;（4）油菜对菌核病的抗性具有中等遗传力,为数量抗性;（5）病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）引发的免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）是油菜对核盘菌产生数量抗性的主要根源;（6）功能基因组学研究表明抗（耐）病油菜材料防卫反应更加剧烈,能有效调控细胞内的氧化还原平衡状态,及时清除过量活性氧（reactive oxygen species,ROS）的积累,抑制细胞死亡。核盘菌-油菜互作分子机制的研究将有助于指导油菜抗菌核病育种。     

甘蓝型油菜类甜蛋白激酶BnTLK1与真菌病害抗性相关

类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）是病程相关蛋白第5家族蛋白，在部分物种中发现有的TLP蛋白C端融合了激酶结构域。为探讨该类融合基因在植物与病原菌互作中的作用，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜中鉴定到一个N端具有TLP结构域，C端为富含丝氨酸苏氨酸受体类激酶结构域的基因（BnTLK1）并成功克隆该基因。序列分析表明BnTLK1第254至276个氨基酸具有典型的跨膜结构，三级结构形成两个明显独立的TLP和激酶结构域。转录组数据显示，该基因在多个组织中表达丰度较低，此外，相比于菌核病感病品种Westar，高抗品种ZY821中其表达丰度较高，且核盘菌诱导后表达明显上调，表明该基因可能参与油菜抗菌核病过程。为了验证BnTLK1对核盘菌等真菌的影响，通过原核表达系统成功表达BnTLK1蛋白，在0.4 mmol/L IPTG和17℃低温条件下诱导培养，最终获得BnTLK1可溶性蛋白，抑菌实验发现BnTLK1能够抑制核盘菌和灰霉菌丝的生长。     

黄绿木霉菌及其混剂对大豆菌核病的诱导抗性初探

采用人工接种方法,测定拮抗菌剂对大豆菌核病的抗扩展能力及相关酶活性的影响,同时研究黄绿木霉菌及其混剂对大豆菌核病的诱导抗性。结果表明:离体试验中,叶片接种后,拮抗细菌和黄绿木霉菌及其混剂均可较好的抑制菌核病病斑的进一步扩展;盆栽试验中,黄绿木霉菌处理对大豆根、第1复叶、第3复叶的PAL、PPO、POD活性均有明显增强作用,而解磷钾菌或拮抗细菌处理对PAL、PPO、POD活性的变化无明显影响,化肥处理则降低PAL、PPO、POD活性;有机肥处理对PAL活性有明显增强作用,对PPO、POD活性无明显影响。     

甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到AtERF104的同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。     

大豆菌核病菌生长特性及抗药性初步测定

采用单菌核分离法得到大豆菌核病菌,利用菌丝生长速率法测定了7株大豆菌核病菌的生物学特性及对多菌灵和腐霉利的抗药性.结果表明:供试菌株菌丝生长的最适温度是15～20℃,而菌核的产生则在15℃左右最多;大豆菌核病菌丝生长最适的环境为中性和偏酸性;不同菌核及病残体埋入土壤不同深度后越冬处理,病残体上菌丝不能越冬,而菌核能够越...     

核盘菌诱导后向日葵防卫及激素信号传导相关基因差异表达分析

为探讨向日葵抗菌核病分子机制，在已构建的核盘菌诱导向日葵转录组差异表达基因分析基础上，筛选了8个向日葵防卫相关基因和水杨酸（SA）、茉莉（JA）及茉莉酸-乙烯（JA/ET）信号途径中的关键调控基因进行了qRT-PCR诱导表达分析。结果表明，当核盘菌侵染向日葵时，向日葵防御酶基因表达量与对照相比均有显著的变化，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）基因在6h表达量分别为对照25.02、22.34和26.25倍；苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和查尔酮合成酶（CHS）基因也上调表达，表达量在12h均达到最高，分别为对照的23.89、24.23和24.89倍；β-1，3-葡聚糖酶（GLU）基因在0～6h下调表达，之后又迅速升高，24h表达量达到最高，为对照的23.66倍；几丁质酶（CHI）基因先是下调表达，12h后开始上调表达，36h时表达量达到最高，为对照的22.13倍。SA、JA及JA/ET信号途径中的调控基因与未经诱导的相比均有明显的转录水平变化，而且JA/ET途径“节”点基因PDF1.2和SA-JA“节”点基因NPR1、MPK4和EDS1也明显上调表达。研究结果表明核盘菌诱导激发了向日葵多种抗病信号传导途径及防御反应，暗示向日葵对核盘菌侵染响应的分子机制受到多基因网络系统的调控。     

栽培大豆种质资源对大豆菌核病的抗性评价

采用离体叶柄接种法鉴定了200份栽培大豆高世代品系对大豆菌核病菌株Jia30和Jian29的抗感反应.结果表明:在所有的参鉴材料中没有发现免疫类型,但各品系间抗性有一定的差异.供试200个品系中既表现抗Jia30菌株义表现抗Jian29菌株的材料占供试材料的2%;抗Jia30菌株的材料占3%;抗Jian29菌株的材料占5%,根据抗性资源筛选结果,这些抗性材料可合理地用于大豆生产,并为大豆抗病育种亲本选择和利用品种布局进行大豆菌核病生态控制提供了依据.     

国内外大豆菌核病鉴定方法研究现状

研究大豆菌核病的鉴定方法是开展抗菌核病育种的基础,对预测病害的发生、流行均具有重要意义。该文就国内外的大豆菌核病鉴定方法方面的研究进行阐述,并提出目前我国大豆抗菌核病鉴定工作中存在的问题。