猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

不同激素处理对猪排卵效果的影响

试验采用孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺烯醇(PG)3种不同的激素,处理后备母猪并进行配种、手术取卵,观测卵巢,收集胚胎并进行胚胎计数.结果表明,孕马血清促性腺激素与人绒毛膜促性腺激素的组合能显著提高母猪胚胎的数量(P＜0.05):而前列腺烯醇处理只表现出诱导发情并能正常排卵的效果,但没有提高胚胎数量的作用(P＞0.05).     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

原核注射转基因猪的准备——诱发发情、超数排卵和原核胚的获取

进行了湖北白猪青年母猪的诱发发情、超数排卵和配种后注射hCG影响胚胎发育阶段的研究,比较了自然发情、诱发发情和超数排卵处理母猪的排卵数、冲卵数和胚胎的发育阶段。结果表明:PG诱发发情效果(51.3%)明显优于PMSG、hCG组合(0);超数排卵两种剂量组合间的差异显著;复配后注射hCG显著地提高了原核胚的数量;自然发情、诱发发情和超数排卵3个处理中,诱发发情组原核胚的数量显著高于其他两组。     

长距离RT-PCR非特异性扩增的鉴定与排除

根据已经测定的乙脑病毒WHe株全基因组序列(GenBank EF107527),设计1对引物扩增基因组全长cDNA和2对特异性的鉴定引物。经RT-PCR技术扩增后,得到约9 kb的产物,经过反复实验,鉴定为外源性污染核酸扩增产物,并加以有效的排除,初步的研究表明该产物可能是由外源性污染核酸自身反向部分互补扩增所致。     

湖北白猪胃蛋白酶原A基因cDNA克隆与序列分析

根据Genebank公布的J04601猪胃蛋白酶原A序列,进行了引物的设计和筛选,通过RT-PCR获得了湖北白猪的胃蛋白酶原A的cDNA序列全长,共1 227 bp(已提交Genebank,登录号EF108301),其具有一个长度为1 158 bp的读码框,编码385个氨基酸,其中包含15个氨基酸组成的信号肽,成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成.与J04601比较,核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%.经PredictProtein分析表明,核苷酸和氨基酸的改变没有造成蛋白质二级结构和功能的变化;并对胃蛋白酶原A基因密码子使用频率和mRNA的二级结构进行了分析,为其载体和宿主的选择以及基因的改造奠定了分子生物学基础.     

sFat-1转基因猪的遗传特性及基因漂移研究

采用PCR检测方法和Southern印迹杂交试验,研究了转sFat-1基因猪的遗传特性及基因漂移情况。结果表明:F1代转sFat-1基因猪能够将外源基因遗传到F2代,F2代仔猪的sFat-1基因阳性比例为32%。F1代及F2代转sFat-1基因猪均没有对同一生产场的猪群产生sFat-1基因漂移。     

转基因动物研究的技术思路

从转基因动物研究的目的出发,探讨转基因动物研究的不同思路,分析使用各种载体所考虑的基本出发点,说明受体动物遴选所需要考虑的因素,总结了转基因方法的技术特点,提出转基因动物检测手段的设计原则,论述了转基因动物繁殖的必要性,为从事转基因动物方面的研究提供技术思路.     

利用渗透压研究猪卵母细胞发育过程中核迁移规律

本研究采用高渗操作液(氯化钠)处理体外成熟卵母细胞。结果表明,发现培养42 h的卵母细胞,中期核与第一极体刚开始分离。培养44 h的卵母细胞,中期核与第一极体已经分离,达到15°。培养46 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达45°。培养48 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达到近90°,中期核开始向卵母细胞中迁移。经过高渗处理的卵母细胞经过后续操作后可以得到克隆个体。结果表明,利用体外成熟培养42~44 h的卵母细胞进行去核操作,可以达到近100%的去核效率,而不会影响胚胎的正常发育。     

猪卵母细胞回收方法对其体外成熟及体外受精的影响

研究采用刺破法、切剖法和抽吸法采集猪卵母细胞,比较3种不同方法对卵母细胞在体外成熟及受精后发育的影响.结果表明:刺破法和切剖法所得A、B级卵母细胞数显著高于抽吸法(P<0.05);三种方法回收的A、B级卵母细胞成熟率差异不显著(P>0.05),但三种方法荻取的A级卵母细胞成熟率均显著高于B级卵母细胞(P<0.05);刺破法得到的成熟卵母细胞受精后的卵裂率显著高于抽吸法(P<0.05),与切剖法相比差异不显著(P>0.05),但在卵裂胚胎中胚胎各发育阶段所占比例相同(P>0.05).