番茄品种浙粉702 DNA指纹图谱构建

用CTAB法提取番茄品种浙粉702及其亲本的基因组DNA,通过CAPS和SSR方法,构建DNA指纹图谱,并用于种子纯度的鉴定。以浙粉702及亲本的基因组DNA为模板进行筛选,结果表明,13对SSR引物扩增产物表现为多态性;CAPS引物扩增得到PCR产物经酶切分析,有17对引物的扩增产物表现出酶切多态性。经种子真伪鉴定、纯度鉴定、定向验证,表明构建的浙粉702指纹图谱有效。     

利用单线虫多重PCR技术快速制备DNA分子量标准

基于单只线虫6对染色体及多重PCR技术建立一种特异性扩增特定长度核酸片段的方法,进而探索其在常规核酸分子量标准制备中的应用。利用多重PCR引物设计及特异性评估软件以秀丽线虫6对染色体为模板,分别设计扩增不同长度核酸片段的特异性引物对,并直接对单只秀丽线虫进行多重PCR扩增,采用20g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定并采集图像,通过系统研究优化获得特异性高的1～6重PCR扩增产物,产物大小经鉴定与预期目的条带一致,6重PCR扩增产物条带与常规分子量标准DL 2 000相应条带完全吻合,说明采用该方法能够有效制备特定片段大小的分子量标准。     

烟草单染色体的分离与扩增及其SSR的检测

以普通烟草根尖为材料,在显微操作仪下分离单染色体,并用LAM-PCR方法进行扩增.对扩增产物用点杂交进行鉴定,用Southern杂交确定目的扩增片段的大小,并用本实验室开发的SSR特异引物检测SSR位点.结果表明:获得的单染色体扩增产物均存在来自烟草基因组的序列,扩增产物大小为250-3000 bp;利用SSR特异引物可以从单染色体扩增产物中检测到目标SSR位点.     

栉孔扇贝和虾夷扇贝通用微卫星引物的筛选及其在杂种鉴定中的应用

[目的]为进行大规模栉孔扇贝×虾夷扇贝群体的杂种鉴定以及家系中的亲子鉴定提供了基础。[方法]将已发表的25对虾夷扇贝的微卫星引物在栉孔扇贝基因组DNA上进行PCR扩增,并利用筛选出的通用引物对栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)进行杂种鉴定。[结果]通过PCR扩增,筛选出6对引物获得扩增产物,其中2对表现为多态性。将这6对具有属间通用性的微卫星引物对栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)进行PCR扩增,均能扩增出特异性条带,其中引物P13F449和KMY134的扩增产物中可以明显地分辨出来自父母本群体的特有条带,从而确定了杂交子代的杂种身份。[结论]虾夷扇贝和栉孔扇贝间通用微卫星引物是存在的,而且部分引物可以直接用于属间杂种的鉴定。     

单、双子叶作物间EST-SSRs引物和标记的通用性研究

【目的】探讨单、双子叶作物间EST-SSR引物和标记的通用性。【方法】选取30对小麦、8对油菜和14对白菜的EST-SSR引物,分别以10个小麦、10个油菜、5个大豆品种和5个玉米自交系的基因组DNA为模板,进行PCR扩增及扩增产物的多态性分析。【结果】(1)30对小麦EST-SSR引物中,有29,28和26对引物分别在玉米、油菜和大豆中有扩增产物,可扩增率分别为96.7%,93.3%和86.7%;其中分别有12对和9对引物在单子叶作物小麦和玉米及双子叶作物大豆和油菜中的扩增产物显示多态性,有4对引物在4种作物中的扩增产物均显示多态性。(2)22对白菜/油菜EST-SSR引物中,有18,21和22对引物分别在大豆、小麦和玉米中有扩增产物,可扩增率分别为81.8%,95.4%和100%;其中分别有10对和7对引物在单子叶作物小麦和玉米及双子叶作物大豆和油菜中的扩增产物显示多态性,有7对引物在4种作物中的扩增产物均显示多态性。【结论】在单、双子叶作物间开发可通用EST-SSR引物和建立可转化EST-SSR标记是可行的;在单、双子叶作物中均有多态性的EST-SSR标记所对应的基因,涉及贮藏蛋白、核酸的转录及复制、功能基因的表达调控、代谢催化等基础功能。     

家蚕RAPD的多态性与稳定性分析

从家蚕品种大造和C108及其F1,F2的后部丝腺提取的基因组DNA通过的RAPD扩增,在477个随机引物中,85.9%的引物在家蚕基因组有稳定的扩增产物,总扩增片段5155条,每个引物扩增片段1-23条,平均为12.6条,多态性片段数共1496条,占两品种中总片段数的29.0%,经多次重复及反复验证发现,只要严格控制扩增反应条件及保证基因组DNA和试剂等不污染,则能检测到稳定的DNA多态性片段,从而保证其稳定性与重复性。     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

沙门氏菌PCR快速检测技术研究

通过改良热裂解法提取沙门氏菌基因组DNA,设计特异性引物进行PCR扩增,并对热裂解的时间进行了比较试验,对PCR检测的敏感性和所用引物的特异性进行了试验.结果表明,煮沸时间为2 min即可获得满足PCR要求的基因组DNA;设计的引物特异性好,能专一性扩增出约500 bp条带;该引物灵敏度高,能进行有效检测的核酸最低起始量为129 pg.采用热裂解法提取沙门氏菌基因组DNA进行PCR快速检测技术大大缩短了沙门氏菌检测时间.     

结球甘蓝无蜡粉亮叶性状dCAPS标记引物优化

研究以野生型结球甘蓝98-1030和无蜡粉亮叶突变型98-1030作为父母本材料,杂交得到F1代,将父母本作全基因组测序,根据所得区间内非同义SNP位点,共设计20对dCAPS引物,命名为DC01～DC20,利用亲本及F1代筛选引物.PCR扩增结果表明,有10对dCAPS引物扩增出条带,限制性内切酶鉴定表明,其中有8对引物PCR产物可酶切产生特异性片段.     

甜椒CMS不育基因ISSR的分子标记

运用ISSR技术对甜椒CMST6A及其相应的保持系T6B基因组DNA进行了比较分析,共使用了44条随机引物,其中33条引物在两系之中都获得了扩增产物.在不育系中获得了1条稳定扩增的特异片段ISSR-81400.通过随机抽取群体的不育和可育单株对ISSR引物进行鉴定,初步认为ISSR-81400可能是与甜椒CMS不育基因连锁的分子标记.     

WHBE兔遗传特异性的RAPD分析

应用随机扩增多态DNA技术(RAPD)对WHBE兔、日本大耳白兔和新西兰兔进行了遗传分析.用10个随机引物对其基因组DNA进行PCR扩增.根据电泳结果选用其中8个引物扩增的条带进行遗传分析,共检测到107条扩增片段,其中多态性片段32条,占29.91%,反映了家兔品系间的遗传变异.多态性统计分析表明,WHBE免和日本大耳白兔的遗传相似度最高,为0.7948.其中4个引物既可扩增出3个品系共同的DNA条带,也可扩增出不同品系的特征条带,表明WHBE兔与日本大耳白兔和新西兰兔之间有遗传的相似性,也存在遗传差异.这些结果表明应用RAPD技术可以很好地检测家兔不同品系间以及同一品系不同个体间的亲缘关系.     

登革病毒E蛋白基因表达载体的构建

利用高效表达载体pET系统，构建广东地区登革流行株E蛋白基因的高效表达载体，表达载体经酶切及测序鉴定表明载体构建正确。为探讨E蛋白在登革病毒致病机制中的作用。以及针对本地登革病毒高效、特异的单克隆抗体和高效价的特异高免血清的制备奠定了基础。     

一串红株型突变体AFLP分析

一串红（Salvia splendens）株型突变体BN35—1分枝能力强,不必摘心,株型自然成球。本研究利用AFLP（amplified fragment lengthpolymorphism）分子标记技术对其进行分析。从21对引物组合中筛选出6对多态性高的引物组合对突变体BN35—1、野生型BN35及4个商品种进行亲缘关系分析以确定BN35—1与BN35亲缘关系。另外用21对供试引物组合单独对突变体及原种进行多态性分析以寻找差异条带。结果表明,BN35—1与BN35亲缘关系最近,相似系数为0．9861,远高于其他商品种、BN35与商品种以及商品种间的相似性。在21对供试引物组合中,12对引物检测出BN35—1与BN35基因组DNA共52处基因座位位点存在差异,相应的特异条带是控制株型突变或与控制株型突变基因相连锁的侯选基因片段,深入研究工作有待进一步进行。     

应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒

根据所有已报道的猪瘟病毒株（HCV）和牛病毒性腹泻病毒株（BVDV）的序列设计了3条引物Pa,Pb,Pc。应用RT-PCR技术，引物对Pa/Pb从猪瘟HCLV株，猪瘟Thiveral株，3株猪瘟野毒株都扩增出了预期185bp的片断，Pa/Pc从BVDVOregonC24V株中也扩增出了240bp的片断，而Pa/Pb与牛睾九原代细胞，PK-15细胞，BVDVOregonC24V株均无反应，Pa/Pc也不与所试验的5株猪瘟毒株反应。采用多重PCR可以从同时含有HCV和BVDV核酸的样品中扩增出各自的特异性条带。针对猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的特异性插入序列。设计了引物Pr,Pra,Prb，可以从HCLV细胞毒或用HCLV人工感染的兔脾组织毒中扩增出预期200bp的片断，而Pr,Pra,Prb与猪瘟Thiveral株和3株猪瘟野毒株均不反应，通过含毒量梯度试验，得出了RT-PCR可检测猪瘟病毒量的下限为200RID或200TCID50。     

Cloning of Partial Sodium Channel Gene From Strains of Fenvalerate-Resistant and Susceptible Cotton Aphid(Aphis gossypii Glover)

The strain of fenvalerate-resistant cotton aphids was selected using fenvalerate insecticide in the laboratory, the resistance factor of the strain was 199.54. Three degenerate primers were designed and used to perform PCR amplification. A cDNA encoding partial sodium channel gene was cloned from the fenvalerate-resistant and -susceptible strains. There were two nucleotide acid differences between fenvalerate-resistant strain and -susceptible strain, resulting in an amino acid mutation, Met→Leu. It is predicted that the mutation is related to the cotton aphid resistance to fenvalerate.     

RAPD鉴别稻瘟病菌生理小种的研究

】采用１６种不同的引物对３株典型的稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）菌株ＺＡ１,ＺＧ１和Ｍ１进行了ＲＡＰＤ分析。结果表明,从杂草马塘与水稻分离的菌株,基因组的差异很大,很容易通过ＲＡＰＤ鉴别这两种不同来源的稻瘟病菌菌株。自水稻分离的菌株,ＲＡＰＤ扩增产物相似性较高,但仍然能够检测出不同生理小种ＤＮＡ带型的差异,证明ＲＡＰＤ可用于稻瘟病菌生理小种的快速鉴别。     

实时荧光定量PCR技术在球毛壳ND35定殖检测中的应用

对球毛壳(Chaetomium globosum)ND35菌株的RAPD扩增特异性DNA片段进行分析,利用Prim-er 5.0软件设计了一对引物,即ND35-1:5'-GCTCGCAGCTCTGGTGCGGT-3',ND35-2:5'-GCCGATTGC-CCATGTCCACCTC-3',以球毛壳ND35菌株基因组DNA为模板,利用此引物建立并优化了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的最佳体系,并据此对杨树和黄瓜两种植物中ND35菌株的定殖情况进行了检测。结果表明,该引物可以用于球毛壳ND35的实时荧光定量PCR检测。     

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对NDVLN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.4%~99.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.4%~99.8%之间。     

中国昆明犬种群遗传关系的RAPD初步研究*

 昆明犬是我国唯一的警用犬种。结合现有种犬群的血统档案,应用RAPD技术对昆明犬的群体［狼青（L）、草黄（C）及黑背（H）品系］进行了遗传分析,从分子生物学的角度探讨了昆明犬的系统发育、各品系之间的亲缘关系和整个种群的遗传多样性。用以筛选出来的11条引物对46个样本犬进行扩增,共检测出85条扩增片段,且均为多态。对46份样本进行UPGMA聚类,研究结果表明：全同胞的犬在较高的相似水平上聚为1组。3品系犬的遗传背景复杂程度依次为：狼青＞黑背＞草黄。经比较,L和C的亲缘关系最近,L和H的亲缘关系较近,H和C的亲缘关系最远。从整个样本群体来讲,昆明犬存在丰富的遗传多样性。