牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

2006—2007年陕西省古典猪瘟流行毒株E0基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的古典猪瘟参考毒株Shi men毒株全基因组序列,设计并合成2对引物,采用巢式RT-PCR技术,从陕西省猪病料中成功扩增出9株猪瘟流行毒株E0全基因并测定其核苷酸序列,与已发表的ALD、Alfort187、Brescia、C HVRI、CAP、Shi men、GXWZ02和HCLV等代表毒株进行同源性比较分析。核苷酸分析表明:这9株猪瘟流行毒株可以分为2大群,1株(LN163)属于群I,与Shi men强毒株、HCLV疫苗株和GXWZ02野毒株等代表株的同源性为80.8%~82.4%;另外8株属于群II,毒株之间E0基因核苷酸序列的同源性为93.6%~99.6%。氨基酸序列分析表明:9株流行毒株中,群I中的LN163毒株与我国野毒参照株GXWZ02的同源性只有83.9%,而其余8株与GXWZ02株氨基酸序列的同源性为94.4%~98.1%,形成明显不同的进化分支;同时这9株流行毒株与我国疫苗株HCLV和经典强毒株Shi men的氨基酸序列同源性分别为88.0%~89.5%和89.1%~91.8%,均呈现较明显的变异。     

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒（CSFV）及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据GenBank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性（翠绿色）,其他非CSFV样本的检测结果均为阴性（桔红色）,且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。     

猪瘟病毒流行株与疫苗株E~(rns)基因的序列分析

 采用RT-PCR技术扩增了HCV 10个野毒株、4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗株和1个标准SM株Erns基因的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的15个HCV毒株与国内外6个参考毒株Alfort、Ald、Brescia、Gpe、C、CW株的相应片段进行了同源性比较分析。15株HCV Erns基因长度均为696 bp,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为83.0%~100.0%和87.9%~100.0%。系统发生分析可将这些毒株分为Ⅰ和Ⅱ两大基因群及4个亚群,Erns基因与E2、     

猪瘟病毒河南野毒株E2基因的克隆及序列分析

旨在了解猪瘟病毒流行毒株的变异情况,为防制猪瘟提供科学依据.根据GenBank上已发表的猪瘟石门株E2基因序列,设计合成了1对特异引物,应用RT-PCR技术对河南省一猪场采集的疑是猪瘟病料的猪瘟野毒E2基因进行扩增,将扩增的E2基因克隆于pGEM-T Easy栽体,对其进行了序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与HCLV株、C株、Alfort株和Brecsia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树.通过PCR扩增得到与预期大小相符的产物,克隆测序验证是E2基因;所扩增的流行野毒与HCLV株、C株、Shimen株、Alfort株和Brecsia株核苷酸序列同源性分别为99.0%,96.5%,93.5%,94.4%和89.9%;氨基酸同源性分别97.8%,94.0%,92.6%,92.0%和91.0%;所绘制的遗传发生树显示所测得流行野毒与C株、HCLV株关系较近.所测的流行株与与中国使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高,说明现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用.     

猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

为给临床快速鉴别诊断猪瘟提供技术依据,根据GenBank公布的CSFV全基因序列,结合猪瘟序列测定结果,针对NS5B基因区域设计2条通用外扩引物、2条通用内扩引物和1条疫苗毒株特异性内扩引物,建立一种可鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR诊断方法。结果显示,该方法可从HCLV株扩增出2条大小分别为261bp和157bp的片段,可从Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株扩增出1条261bp的片段,其他几种常见猪病毒检测均呈阴性;灵敏度试验表明,检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7 pg/L;116份临床样品中有37份样品检测呈阳性,阳性率为32%;分析部分阳性病料E2基因序列也证实检测结果的准确性。说明:建立的RT-nPCR鉴别诊断方法灵敏度高、特异性好,能直观区分猪瘟疫苗毒株和流行毒株。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

2个猪瘟野毒株E2基因主要抗原区域的扩增及其序列分析

用RT-PCR技术对华东地区2份猪瘟病料的E2基因主要抗原编码区域进行了扩增和序列分析。结果表明这2个毒株的棱苷酸序列同源性为97．321％、氨基酸序列同湃性为100％，但2个毒株的序列与我国的标准强毒Shimen株、疫苗毒HCLV株的差异较大，核苷酸序列、氨基酸序列均只有80％左右，与法国Alfort、意大利C1W株棱苷酸和氨基酸序列的同源性分别为84％～87％和91％。参考国内外对猪瘟病毒基因组的分型方法，将这2株猪瘟病毒归为基因Ⅱ型。     

猪戊型肝炎病毒RT-nPCR检测方法的建立及应用

建立猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E Virus,SHEV)RT-PCR检测方法,为SHEV的流行病学调查、临床诊断提供可靠的技术手段。根据SHEV的基因组序列,设计并合成2对引物,以SHEV江西分离株SHEV-JX-1为模板,对反应条件进行了优化,建立了诊断SHEV的RT-PCR方法。该方法可从SHEV-JX-1中扩增出230 bp的片段,测序结果表明为SHEVⅣ型基因片段;对猪的其它病毒进行检测结果均为阴性;能检测出2.5×10-8μg的SHEV RNA;对江西部分猪场采集的胆汁及肠容物进行检测,结果胆汁中的阳性率为10%,肠容物的阳性率为4%。实验建立的RT-PCR方法具有敏感、特异、重复性好的特点,可用于SHEV的分子流行病学调查和临床快速诊断。     

用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究

利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,利用N基因引物也从同样的7份病料中扩增出586 bp的核酸片段。其余病料的检测结果为阴性。2对引物对病料的检测结果一致。     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。     

鸭副粘病毒与H9亚型禽流感病毒双重PCR检测方法的初步建立

通过对GenBank发表的鸭副粘病毒(DPV)和鸭H9亚型禽流感病毒(AIV,H9)基因序列分析,针对保守区分别设计并合成2对特异性引物.通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法.结果表明,该检测方法可同时扩增出DPV (363 bp)和H9亚型AIV (732 bp)的特异性片段,而对照DHV、I...     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株

根据IBV Beaudette株全基因组序列，借助基因分析软件自行设计合成了3个引物（youl,you2-youM ),引物you1 和you2-在S1基因两则，跨幅为1611bp,引物you2-和youM 在S1基因的3‘端，跨幅为535bp，用引物you1 和you2-对5个IBV地方分离株（HN2、HN4、JX1、SC2和SC4）进行RT－PCR，均成功地扩增出预期大小的目的片段，对RT－PCR的产物用限制性内切酶PstI进行酶切分析，结果酶切产物中得到2条条带，大小分别为560和1050bp，与GeneBank中11株已发表的S1基因分析结果一致，初步鉴定结果显示，已经成功分离得到了IBV－S1基因。     

侵染荷兰郁金香的郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

以从荷兰引进的4个郁金香品种病株为材料,利用马铃薯Y病毒的简并引物和黄瓜花叶病毒CP基因的一对特异引物,通过RT-PCR技术分别扩增出与预期大小相一致的1 800 bp和840 bp左右的片段,而对照无任何产物.感受态转化后,进行测序,结果表明田野、多道多、雪莉和克思尼4个品种中均能检测到郁金香碎色病毒和黄瓜花叶病毒.     

半套式RT-PCR法检测腹泻延边黄牛血液伤寒沙门氏菌试验

为建立一种快速、特异性和实用性强、灵敏度高的沙门氏菌检测方法,参考GeneBank中登录号为U25631的沙门氏菌基因序列.设计并合成引物,组成半套式RT-PCR,扩增片段为581bp.应用该半套式RT-PCR对标准菌株伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌和结核杆菌及临床伤寒分离出的沙门氏菌H1、H2株进行检测.并对延边地区牧场的产生-临床腹泻的延边黄牛血液中分离培养的不同菌株进行检测.结果表明,仪伤寒沙门氏菌标准株和临床一株样品在581bp处扩增出了特异的片段;该方法检测灵敏度为1 fg 核酸,且重复性好.说明此半套式RT-PCR法可以准确、灵敏、快速地检测出腹泻延边黄牛血液中的伤寒沙门氏菌.     

山西省马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了1对引物,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到852 bp的基因片段并进行了序列测定。BLAST分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性最高可达99%。     

牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立

根据Genbank发表的牛呼吸道综合征相关病毒中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)N基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR和牛副流感3型病毒(BPIV3)N基因设计特异性引物,建立了在同一体系内同时对4种病毒进行检测的多重PCR方法。该方法可以同时检测出DNA病毒IBRV的长306bp和反转录病毒BPIV3长422bp、BRSV长600bp及BVDV长130bp的特异性片段。本项研究中以已知IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV作为参考毒株,对来自内蒙古、辽宁、安徽和吉林4个省、自治区的33例临床样品进行检测。结果表明,合并感染2种病毒较为多见,分别为BVDV和BRSV共感染,BPIV3和BRSV共感染,BPIV3和IBRV共感染,未检测到4种病毒同时感染临床样品。