重组大肠杆菌肠毒素蛋白LTA_(192)-STa_(13)的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究

为研究重组大肠杆菌肠毒素融合蛋白LTA192-STa13的免疫原性,本研究将产肠毒素大肠杆菌(ETEC)elt A和est A基因定点突变后构建融合基因,进行重组蛋白LTAR192G-STaG13Q的表达。利用纯化的重组蛋白和灭活菌液分别免疫小鼠,比较不同抗原诱导小鼠体液免疫应答能力,以及体外免疫血清对毒素的中和作用。结果显示,各组免疫小鼠均可以产生高滴度抗LTA和STa抗体,其血清抗体可以通过乳汁传递给新生仔鼠,其中蛋白免疫组血清抗体效价更高。体内外中和试验证明,实验组小鼠三免后的血清能够中和LT和STa毒素对实验鼠的毒性作用,并且能够中和LT对Y-1细胞的毒性作用,蛋白免疫组血清抗体中和效价可达到1∶89.13,明显高于灭活菌免疫组。研究表明,重组蛋白LTA192-STa13对小鼠具有良好的免疫原性,能够诱导免疫鼠产生良好的体液免疫应答,可以作为ETEC亚单位疫苗的候选抗原。     

地高辛标记空肠弯曲菌DNA探针的研究

应用地高辛标记核酸技术将地高辛结合到空肠弯曲菌染色体 Ｄ Ｎ Ａ 上，制备了地高辛标记的 Ｄ Ｎ Ａ 探针。地高辛标记的空肠弯曲菌 Ｄ Ｎ Ａ 探针仅与空肠弯曲 Ｃ Ｊ１、 Ｃ Ｊ２ 发生反应，而与大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副结核分枝杆 菌不发生反应，具有很高的特异性。其敏感性可检测出０．２２ ｎｇ 的样品 Ｄ Ｎ Ａ，较光生物素（８ ｎｇ）、 Ｐ同位素（４ ｎｇ）标记的核酸探针高。     

感染大肠杆菌F17湖羊羔羊脾脏中差异circRNA分析

【背景】羊大肠杆菌病是一种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病,是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一,尤其是初生羔羊易被产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染,引起羔羊腹泻,又叫羔羊白痢,使养殖场遭受严重的经济损失。而传统的抗生素治疗方案存在诸多缺陷。【目的】 本研究通过让湖羊羔羊口服大肠杆菌 F17菌株获得不腹泻和腹泻的羔羊个体,筛选出服用大肠杆菌F17菌毛后不腹泻与腹泻型个体中差异表达的circRNA,进而探究circRNA在绵羊抗腹泻中的作用,从而发现与抗大肠杆菌病性状相关的候选基因。从circRNA层面上,加深对绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的认识,确定绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的功能基因。【方法】用CIRI软件从头预测circRNA,利用RNA-seq技术,首次筛选出感染大肠杆菌F17菌株后不腹泻与腹泻型羔羊个体脾脏中差异表达的(DE)circRNA,对差异表达转录本进行GO富集分析,结合GO注释结果对其功能进行描述。统计每个GO条目中所包括的差异转录本个数,并用Fisher's exact test计算每个GO条目中差异转录本富集的显著性。然后随机选择6个DE circRNA,利用q-PCR分别验证这6个DE circRNA在不腹泻和腹泻组羔羊脾脏内的相对表达水平,进而利用Miranda软件来预测与miRNA结合的circRNA以及miRNA的靶基因,根据miRNA靶基因的功能注释来阐明此部分circRNA的功能,分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,最后用q-PCR验证circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平。【结果】 绘制参考序列后,鉴定出已知的7 730个circRNA,DE circRNA与GO 数据库进行比对,发现一共有60条circRNA被注释和分类到297个功能亚类中。利用RNA-seq在不腹泻和腹泻羔羊脾脏中筛选出60个差异表达的(DE) circRNA,其中31个上调和29个下调,用q-PCR验证随机选择的6个DE circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。利用Miranda分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,发现6个circRNA、5个miRNA和8个mRNA之间存在一定的靶标关系,用q-PCR验证mRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。【结论】 探究了对于不腹泻和腹泻羔羊脾脏中circRNA的表达谱,进一步了解其在绵羊抗病发生过程中的调控作用。发现了不腹泻和腹泻羔羊脾脏中差异表达的circRNA,有助于找出羔羊如何抵抗腹泻的发生机制,为羔羊抵抗腹泻提供科学的依据。     

猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。     

新型凝集技术快速检测产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究

为建立以彩色二氧化硅微球(CSN)为载体,快速检测产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌毛K88ab、K99、987p和F41的新型凝集技术,本研究采用反相微乳液法制备二氧化硅微球,将其与菌毛单因子血清偶联制成免疫彩色二氧化硅微球(ICSN),通过优化反应条件建立了快速检测ETEC菌毛的方法。特异性试验结果显示,ICSN只与携带其对应菌毛的菌株发生反应,与携带其它菌毛的菌株无交叉反应;敏感性试验结果显示菌液的最小检出浓度为1.0×10~6cfu/m L~5.1×10~6cfu/m L;稳定性试验显示4℃保存30 d,ICSN特异性、敏感性无明显变化;双盲样品检测准确率为100%。本研究有助于ETEC菌毛的快速检测和幼畜大肠杆菌性腹泻的诊断。     

抗大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备和鉴定

为了研究用不耐热肠毒素B亚基(LTB)和耐热肠毒素(STa)的融合蛋白制备鸡卵黄抗体的方法及其中和作用,试验将LTB和STa的编码基因串联并在大肠杆菌中表达获得了重组蛋白,以重组蛋白为免疫原免疫8月龄海兰蛋鸡制备了卵黄抗体,分别用兔肠段结扎试验和乳鼠灌胃试验进行了卵黄抗体对不耐热肠毒素(LT)和STa的体内中和试验。结果表明:用LTB和STa融合蛋白免疫产蛋鸡可诱导产生抗LTB和STa的卵黄抗体,其中抗LTB效价最高可达1∶8 647,抗STa效价最高可达1∶768;卵黄抗体对LT和STa均有中和作用。说明用融合蛋白作为免疫原制备的卵黄抗体具有抗LT和STa的生物学活性,对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗有潜在的应用价值。     

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法.该方法对Kss、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性.本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法.用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性.     

各旋毛虫隔种对猪的感染性试验

用消化法所得的猪旋毛虫、犬旋毛虫、旋毛形线虫 (Trichinellaspiralis)和本地毛形线虫 (Trichinellanativa)分别感染健康猪。结果表明 :4个旋毛虫隔离种对猪的感染性存在着明显差异 ,猪旋毛虫和T .spiralis对猪易感 ,其繁殖力指数 (RCI)分别为 385 .6 8± 41.5 1和 30 0 .5 5± 12 .45 ;而犬旋毛虫和T .nativa对猪不易感 ,RCI分别是 0 .0 6 4± 0 .0 31和 0 .0 33± 0 .0 33。结果揭示黑龙江省猪旋毛虫相当于T .spiralis,犬旋毛虫相当于T .nativa ;犬旋毛虫和T .nativa很难通过猪的感染而对人体健康构成威胁。     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选

本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀 H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过 H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感 H9N2亚型病毒进行 HA 基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉 HI 效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉 HI 效价及中和效价最高。HI 试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感 H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支 H9疫苗株联合更有利于控制 H9型禽流感,