抗大肠杆菌肠毒素卵黄抗体的制备和鉴定

为了研究用不耐热肠毒素B亚基(LTB)和耐热肠毒素(STa)的融合蛋白制备鸡卵黄抗体的方法及其中和作用,试验将LTB和STa的编码基因串联并在大肠杆菌中表达获得了重组蛋白,以重组蛋白为免疫原免疫8月龄海兰蛋鸡制备了卵黄抗体,分别用兔肠段结扎试验和乳鼠灌胃试验进行了卵黄抗体对不耐热肠毒素(LT)和STa的体内中和试验。结果表明:用LTB和STa融合蛋白免疫产蛋鸡可诱导产生抗LTB和STa的卵黄抗体,其中抗LTB效价最高可达1∶8 647,抗STa效价最高可达1∶768;卵黄抗体对LT和STa均有中和作用。说明用融合蛋白作为免疫原制备的卵黄抗体具有抗LT和STa的生物学活性,对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗有潜在的应用价值。     

产肠毒素大肠杆菌FaeG-mSTa-LTb-STb融合表达及其包涵体口服免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛主要结构蛋白Fae G、STa、LTb和STb毒素融合蛋白的免疫原性,本研究采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增编码Fae G-m STa(STa突变体)-LTb-STb 4种蛋白融合基因,将其克隆于p Pro EXHTa表达载体中进行原核表达。并以表达的包涵体口服免疫BALB/c小鼠,通过检测免疫鼠的体液和细胞免疫反应,评价其免疫效果。实验结果显示,融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达,并可以被特异性抗体所识别,具有良好的反应原性。免疫小鼠后均能够产生特异性Ig G和s Ig A,并诱导产生细胞免疫应答。免疫记忆反应试验证明,免疫鼠至少在3个月内保持对特异性抗原的免疫记忆应答。本研究结果表明,Fae G-m STa-LTb-STb融合蛋白具有良好的免疫原性,口服包涵体免疫是一种可行的免疫途径,提示所制备的融合蛋白作为口服疫苗抗原具有潜在的应用价值。     

产不耐热肠毒素大肠杆菌减毒突变菌株的毒性和免疫应答评价

为探究表达不耐热肠毒素突变体(mLT)的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)突变菌株黏膜免疫原性以及作为口服疫苗的应用前景,本研究采用细菌平板计数法、电镜观察和药物敏感试验检测了已构建的mLT突变菌株在LB液体培养基和人工胃肠环境下的生长曲线、菌毛生长和对抗生素的耐药性能,结果显示E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R和E.coli mLT-R192G3突变菌株的生长曲线、菌毛生长和耐药性与亲本菌株基本一致;经PCR和细菌黏附性试验检测,3株菌的突变基因遗传稳定,并且具有和亲本菌株相当的黏附能力;采用家兔肠袢结扎试验和鼠肾上腺皮质细胞(Y1)毒性试验对突变菌株产生的mLT的毒性进行检测,结果显示,3株突变菌株所产生的mLT均具有体内肠毒性,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,为10~(3.476) TCID_(50)/0.1 mL,是亲本菌株E.coli C83903 LT毒性(10~(7.614)TCID_(50)/0.1 mL)的1/10 000;小鼠口服突变菌后,观察小鼠临床表现,采用ELISA和中和试验检测小鼠产生的特异性抗体及其中和活性,采用MTT法测定淋巴细胞的增殖情况,结果显示,口服突变菌株对小鼠安全,能够诱导小鼠产生局部黏膜免疫应答、体液免疫应答以及细胞免疫应答,小鼠产生特异性的IgG和sIgA且对LT均具有中和活性。3株突变菌株均具有良好的免疫原性,其中E.coli mLT-S63K所产生的mLT毒性更弱,且黏膜免疫效果更好,可作为ETEC 口服疫苗的候选菌株。本研究通过减毒突变构建了表达mLT的ETEC突变菌株,并筛选出毒性弱,免疫原性好,遗传稳定的ETEC 口服疫苗候选菌株,为仔猪大肠杆菌性腹泻新型疫苗的研究提供了实验数据。     

抗STa多克隆抗体的制备、鉴定和纯化

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)可引起人及动物急性腹泻,其关键毒力因子为耐热肠毒素(ST)。由于ST是一种具有强烈毒性但缺乏免疫原性的小分子肽,如何在保持其免疫原性的同时减弱其毒性已成为制备ST类毒素疫苗的研究热点。本试验以利凡诺法提纯兔血清白蛋白(RSA),经0.2%戊二醛活化,再与人工合成的甲醇可溶性STa偶联,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示获得分子质量约108.5 ku的完全抗原。用该偶联物免疫新西兰白兔4次,采集抗血清并用Protein A/G 琼脂糖小珠进行纯化,斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)和免疫印迹(Western blotting)结果显示抗血清效价均为1:400。试验结果表明抗STa多克隆抗体成功制备,这为筛选ST结构类似物做有益的铺垫。     

产肠毒素大肠杆菌STa突变体、LTB和STb融合蛋白在乳酸菌中组成型分泌表达及其免疫原性分析

为获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)抗原STa突变体(mSTa)、LTb和STb融合蛋白在乳酸菌表达系统中组成型分泌表达,本研究将mSTa、LTb、STb三价抗原融合基因,克隆于p23启动子-USP45分泌信号肽之后,插入到乳酸乳球菌表达载体pTX8048中,构建了重组表达载体pTX-sls,将其电转化到宿主菌乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中进行表达,应用westernblot、ELISA方法鉴定蛋白表达情况。将重组乳酸乳球菌pTX-sls/NZ9000口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,流式细胞术检测Th细胞免疫类型。结果显示,目的蛋白mSTa-LTB-STb以分泌形式组成型表达,可被阳性血清所识别。在免疫小鼠血清和粪便中均可检测到特异性IgG、sIgA,血清抗体具有一定的中和毒素作用。结果表明,该重组乳酸乳球菌具有作为口服疫苗的潜在应用价值,本研究为研制ETEC乳酸菌活载体口服疫苗奠定了基础。     

犬Ⅰ型腺病毒结构蛋白Knob的可溶性表达及免疫原性研究

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1, CAdV-1)F1301株结构蛋白Knob的免疫原性,试验采用原核表达技术将Knob蛋白基因克隆到pColdⅡ原核表达载体中进行低温诱导,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中实现可溶性表达。利用纯化后的重组蛋白Knob免疫Balb/c小鼠,监测免疫后小鼠血清中重组蛋白Knob特异性抗体ELISA效价、病毒中和抗体效价,测定脾脏T淋巴细胞增殖活性,研究重组蛋白Knob的免疫原性。结果表明:表达的重组蛋白Knob为可溶性蛋白,分子质量约为20 ku。第2次免疫后7,14天,试验组小鼠血清ELISA抗体效价分别为1∶6 400和1∶3 200,中和抗体效价分别为1∶118和1∶96。第2次免疫后7天,试验组小鼠T淋巴细胞增殖指数为1.322,显著高于对照组(P0.05)。说明试验成功表达出CAdV-1重组蛋白Knob,所表达的重组蛋白Knob具有良好的免疫原性且存在CAdV-1的中和抗原表位。     

产热敏肠毒素大肠杆菌小鼠攻毒模型的建立

大肠杆菌中产肠毒素大肠杆菌(ETEC) 对幼畜消化道有致病性,肠毒素是ETEC在体内或体外生长时产生并分泌到胞外的一种蛋白质性毒素,按其对热的耐受性还可分为热敏感肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)[1].LT是分子量较大的蛋白质(88 kDa),无透析性,硫酸铵能使其沉淀[2].LT亚单位具有良好的免疫原性,而ST不具有免疫原性,机体接触LT后可产生强烈的体液免疫反应和黏膜免疫反应[3].因此,确定LT的攻毒模型有重要的意义.     

猪源产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88)和毒素(STa和LT)基因分别设计合成了1对引物,对K88、STa和LT基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、STa和LT的三重PCR方法。该方法对K88、STa和LT基因的扩增产物分别为499 bp,190 bp和373 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的三重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的三重PCR方法对实验室从临床腹泻样品中分离的120株大肠杆菌进行检测,结果 9株为K88/LT/STa阳性,14株为K88/LT阳性,21株K88/STa阳性,13株LT/STa阳性,8株K88阳性,2株LT阳性,12株STa阳性。     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。     

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5).经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.免疫试验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用.用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗2 MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击.由此表明,构建的工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株.     

伪狂犬病病毒囊膜蛋白ISCOMs免疫原性测定

应用伪狂犬病病毒囊膜蛋白与Quil A结合制备囊膜蛋白免疫刺激复合物(PRV-ISCOMs)，并通过ELISA、血清中和试验和淋巴细胞转化试验(Brdu-ELISA法)测定其诱导小鼠体液和细胞免疫应答水平。结果如下：1)小鼠分别接种3、7、10ug的PRV-ISCOMs后，于接种后PI7d血清中可测出ELISA IgG而抗体，随后抗体水平逐渐升高。间隔21d加强免疫后，FLISA IgG抗体水平进一步提高，且中和抗体效价均在1：22以上，而未加佐剂的囊膜蛋白对照组均无中和抗体；2)淋巴细胞转化试验初步结果表明PRV-ISCOMs能诱导小鼠的细胞免疫应答。3)免疫保护力测定显示免疫鼠能抵抗强毒攻击。上述结果表明PRV-ISCOMs具有良好的免疫原性，能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的分子生物学及粘膜免疫佐剂效应

大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-Labile,LT)是由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)分泌的一种外毒素。LT既有较强的免疫原性又有较强的粘膜佐剂效应,其毒力较霍乱毒素(choleratoxin,CT)小而被认为是替代CT的最有潜力的粘膜免疫佐剂。本文从LT的分子结构、分子生物学特性、免疫原性、粘膜佐剂效应及其作用机制以及LT的粘膜免疫佐剂的应用等方面进行了讨论。     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

大肠杆菌热敏肠毒素对家兔和猪的免疫试验

用一株猪源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的全细胞培养物加多粘菌素B制备的热敏肠毒素(LT),在4℃下保存期可达218天以上,用LT抗原加佐剂制苗,免疫家兔,其血清琼扩抗体效价可达8～32倍。以2～16倍同源菌株的LT作兔肠结扎攻毒试验,免疫兔肠道液体分泌量降低50％以上。用LT氢氧化铝苗免疫孕猪后,经临床观察其对仔猪的保护率为65.9％(P<0.01)。用琼扩法测母猪的初乳抗体,免疫组14头猜中有10头初乳抗体阳性,对照猪16头,有5头阳性.     

葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对肠毒素大肠杆菌(ETEC)生长及毒力相关基因mRNA表达的影响

为了研究葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对肠毒素大肠杆菌(ETEC)生长及分泌毒素的影响,在ETEC菌液中加入终浓度为200μg/mL的葛根素,终浓度为1μg/mL的黄芩苷,以及终浓度为100μg/mL的盐酸小檗碱,检测葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对ETEC生长情况、菌毛亚基蛋白FaeG以及毒力因子(STa、STb和LT) mRNA表达的影响,结果发现,葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱对ETEC的生长有一定的抑制作用,其中黄芩苷可显著抑制ETEC分泌外毒素。     

牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素重组亚单位疫苗诱导小鼠免疫保护效果的观察

以大肠杆菌表达系统表达并纯化的牛源坏死杆菌H05菌株5个截短的重组白细胞毒素蛋白PL1（1aa～174aa）、PL2（311aa～644aa）、1ktA3（1319aa～2026aa）、PL4（1960aa～2287aa）和PL5（3077aa～3241aa）为抗原分别免疫昆明系小白鼠,同时将灭活的天然坏死杆菌白细胞毒素和PBS作为免疫对照。ELISA结果显示,经4次免疫后5个重组蛋白和天然白细胞毒素均能介导小鼠产生抗白细胞毒素蛋白的特异性抗体,抗体效价分别为1：6400、1：12800、1：6400、1：12800、1：3200和1：800。免疫鼠活菌攻击观察结果和免疫鼠肝脏组织学变化结果一致证明,PL1、PL2、1ktA3、PL4、PL5重组蛋白和天然白细胞毒素对小鼠均具有保护作用,5个重组蛋白的免疫保护作用均优于天然白细胞毒素,在5个重组蛋白中PL1、1ktA3和PL4对鼠的免疫保护效果最好。     

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白受体结合区(PEDV-RBD)重组蛋白的免疫原性

利用杆状病毒表达系统制备猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白(PEDV-RBD),将其免疫3周龄断乳仔猪,分析其免疫原性。将PEDV-RBD P3代重组杆状病毒接种到悬浮SF9细胞中,收获后离心取上清液,将上清液超速离心浓缩重组蛋白。将仔猪分为免疫组、空载体对照组和佐剂对照组,分别用制备的重组蛋白、空载体表达产物和单纯佐剂免疫仔猪。结果显示,免疫后8周,PEDV-RBD重组蛋白组产生的特异性抗体效价达1∶12 800,中和抗体平均效价1∶284,最高达1∶512。流式细胞术分析CD3⁺CD4⁺双阳性T淋巴细胞显著高于对照组,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,能够激发仔猪的体液免疫和细胞免疫应答。该研究为猪流行性腹泻疫苗研制提供了理论依据。     

兔血清白蛋白及其耐热肠毒素偶联物的制备

耐热肠毒素(STa)是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起仔猪黄白痢的关键毒力因子,但其本身在动物体内无免疫原性。本试验为制备基于STa的完全抗原,首先采用利凡诺沉淀法纯化兔血清白蛋白(RSA),以RSA为载体,以戊二醛为交联剂,采用两步交联法制备STa与RSA的共价偶联物,再经凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定偶联效果,测定偶联物分子量及偶联比。电泳结果显示RSA及其STa偶联物制备获得成功,偶联物呈单一条带,分子量约为108.5 KDa,STa与RSA偶联比(摩尔比)为20.5∶1。本试验结果可为制备抗STa特异性抗体、研发STa检测试剂盒、筛选STa减毒突变体及发展仔猪黄白痢类毒素疫苗提供必需的实验材料。     

抗大肠杆菌耐热肠毒素中药方剂的筛选

肠毒素是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)在体内或体外生长时产生并分泌到胞外的一种蛋白质性毒素,按其对热的耐受性还可分为热敏感肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST) .大肠杆菌耐热肠毒素(ST)由分子量不足5 000的多肽组成,无免疫原性.     

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的 共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。