松江鲈肾组织细胞系生物学特性研究

在25℃、5%CO_2实验室条件下,于20%FBS-DMEM/F12培养基中培养松江鲈肾组织细胞系,以研究其生物学特性。第75代松江鲈肾组织细胞传代培养后,0～2 d处于潜伏期,2～4 d进入对数生长期,4～6 d进入稳定期,其群体倍增时间为55.2 h。经液氮冷冻保藏1月后,复苏细胞的存活率为(90.8±1.37)%。35代松江鲈肾组织细胞的染色体数为2n=40,核型公式为K(2n)=16m+10sm+14t。病毒敏感性试验表明,松江鲈肾组织细胞对鱼类诺达病毒不敏感,对鲤春病毒血症病毒敏感,测定病毒滴度为10~(6.53)/mL。镉离子敏感性试验显示,松江鲈肾细胞存活率随着氯化镉浓度的升高而降低,半致死浓度为(130±9.1)μmol/L,可用来作为镉离子检测的生物学指标。     

泥鳅MSAP技术反应体系的建立及优化

为获得不同倍性泥鳅基因组DNA甲基化水平及模式,以泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,利用正交试验建立了甲基化敏感扩增多态性( MSAP)方法的反应体系,并利用该方法对二倍体泥鳅鳍基因组DNA进行了MSAP分析。结果表明：最佳双酶切反应体系为800 ng的泥鳅基因组DNA,用EcoR I、 Hpa II和Msp I各10 U,在37℃下反应8 h后即可酶切;最佳预扩增反应体系为模板4μL、预扩增引物0·8μL、0·2 mmol/L dNTPs、1·5 mmol/L Mg2+和 Taq 1 U;最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释20倍的模板2μL、引物1·5μL、0·375 mmol/L dNTPs、1·5 mmol/L Mg2+和 Taq 1 U;二倍体泥鳅全甲基化率分别为24·1%、20·8%、22·3%,半甲基化率分别41·4%、20·8%、33·3%,总甲基化率分别为65·5%、41·6%、55·6%。研究表明,该反应体系稳定、可靠、重复性好,为MSAP技术在多倍体泥鳅相关研究中的应用奠定了基础。     

松江鲈脾组织细胞的短期培养及染色体分析

采用组织块法对体质量为120~140 g的松江鲈Trachidermus fasciatus脾组织细胞进行短期培养并对染色体进行了分析。结果表明:在p H为7.2、温度为25℃的条件下,松江鲈脾组织细胞在含有20%南美胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维样细胞生长因子(b FGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)的培养基中,生长良好,迁出细胞有悬浮和贴壁两种形式;悬浮细胞为圆形和椭圆形,贴壁细胞呈变形细胞样和成纤维细胞样;利用悬浮细胞进行的染色体分析显示,松江鲈的染色体数2n=40,核型公式为14m+10sm+16t。本研究结果为松江鲈脾组织细胞系的构建奠定了基础,并初步建立了利用短期培养的脾组织细胞制备染色体的方法。     

饥饿和再投喂对中间球海胆性腺发育的影响

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius进行了不同时间的饥饿和再投喂试验。采用各组“饥饿时间 投喂时间”相同的试验设计,在30 d内,试验组(S3、S6、S9、S12组)海胆分别饥饿3、6、9和12d后再连续饱食投喂直至试验结束,同时设对照组S0。结果表明:试验结束时S3组海胆性腺重、性腺指数均接近对照组,其余各组较对照组低;特殊生长率在再投喂的第2 d或第4 d出现最大值。性腺组织学观察的结果表明:对照组海胆性腺为滤泡型,由生殖细胞和营养细胞构成,发育至生长期;随着饥饿时间的延长,雄海胆性腺中成熟精子的数量减少,雌海胆性腺中初级卵母细胞发育迟缓,而雌、雄海胆性腺中营养细胞的数量无明显变化;再投喂后,性腺有不同程度的发育。     

仿刺参体壁手术缝合方法的研究

以仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,建立了一种海参体壁手术缝合的方法.将体质量为(55±2.6)g的仿刺参放入盛有0.54 mol/L硫酸镁溶液的解剖盘中麻醉1h,然后用灭菌手术刀沿腹后部1/3处往前纵向切开约2 cm切口,深至体腔.采用单纯对合缝合法进行缝合,缝合后放回加有抗生素的水槽中培育.结果表明:试验组仿刺参伤口经缝合后,创口在10 d时已基本愈合,20d时切口处组织与正常组织没有区别,且在培育过程中,化皮率为10％,死亡率仅为5％;对照组伤口未经缝合,其创口愈合时间较试验组平均慢10 d,且化皮率高达58.7％,死亡率为51.7％.该方法可应用到海参的创伤试验研究以及养殖生产中.     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

仿刺参纵肌带再生的形态学和组织学

采用人工创伤的方法剪断仿刺参(Apostichopus japonicus)体腔背部的纵肌带, 然后缝合切口处的体壁, 将其在添加抗生素(100 IU/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素)的海水中继续饲养。通过形态学和组织学方法对仿刺参纵肌带再生过程中的结构变化进行了观察。形态学结果显示, 创伤后0 h, 由于纵肌带的收缩, 断端出现0.5~1 cm的间隙; 创伤15 d, 创伤处出现乳白色絮状组织, 暂命名为肌前组织; 创伤30~45 d时, 肌前组织逐渐增厚并将断端肌肉组织连接起来; 创伤60~90 d, 肌前组织已转化成纵肌带, 并且其厚度增至正常纵肌带的1/2; 创伤后110~130 d, 新生纵肌带进一步增粗, 形态上与未创伤处组织没有区别, 只是直径略小一些; 创伤150 d, 再生的纵肌带厚度同正常状态。组织学结果显示, 创伤后15 d, 在损伤处出现结缔组织及单个的肌纤维, 形成一条不规则的细长条带, 即肌前组织; 创伤后30~45 d, 肌前组织中肌细胞数量大量增加, 并与体壁间形成一些“桥状”连接; 创伤后60~90 d, 肌前组织几乎被肌纤维占据, 且“桥状”连接数量增加, 此时肌前组织已转化为肌肉带(纵肌带); 创伤后110~130 d, 新生肌纤维数量大量增加, 和体壁相连的“桥状”连接数量减少, 创伤150 d, 新生的纵肌带基本达到正常的结构, 且“桥状”连接消失。分析认为仿刺参纵肌带具有较强的再生能力, 且新生的肌细胞来源于体壁结缔组织细胞和体腔上皮细胞。

     

利用AFLP技术分析海扇贝与三种扇贝的亲缘关系

本研究采用AFLP技术,对2005年引自加拿大的海扇贝(Placopecten magellanicus)以及中国北方主要养殖的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)进行了遗传学比较分析。结果表明,共用5对AFLP引物进行了扩增,共扩增出501个位点,多态性位点为392个,多态位点比例为78.24%。平均Nei氏基因多样性指数H分别为0.2139、0.1684、0.1441和0.1670,平均Shannon氏指数I分别为0.3356、0.2681、0.2439和0.2656。海扇贝多态位点比例、Nei氏基因多样性指数和Shannon氏指数均处在较高水平,说明海扇贝遗传多样性较高。UPGMA聚类结果表明,海扇贝与虾夷扇贝亲缘关系最近。     

干露及恢复过程中菲律宾蛤仔免疫指标的变化

在滩涂养殖和运输过程中,菲律宾蛤仔经常处于干露状态。笔者研究了蛤仔在干露胁迫和随后的恢复过程中酶活力和免疫相关物质含量的变化,初步揭示了滩涂贝类耐干露的生理学机制。在蛤仔干露12、24、48 h,以及恢复培养2、6、12、24 h时分别取蛤仔鳃和内脏团,测定酶活力及免疫相关物质含量,设持续海水养殖的蛤仔为对照组。结果表明,蛤仔在干露胁迫12 h和24 h时,内脏团AKP活力显著高于对照组(P<0.05);CAT活性在整个实验中与对照组差异不显著(P>0.05),鳃中AKP和CAT活力与对照组差异不大;内脏团SOD活力在干露12 h时显著升高,而鳃中SOD活力在恢复期显著升高(P<0.05);内脏团中MDA含量在干露24 h时显著高于对照组,鳃中MDA含量在干露12 h和24 h时显著低于对照组;内脏团NO含量在恢复海水后6 h时显著高于对照组(P<0.05),而鳃在干露48 h时NO含量显著高于对照组。分析认为,干露过程中,蛤仔呼吸代谢减慢,鳃的生理机能维持平稳或受到抑制,代谢和免疫保护作用主要由内脏团来完成。恢复培养时,随着呼吸作用和血液循环的恢复,鳃逐渐承担起部分抗氧化功能,使机体迅速恢复到正常生理状态。     

中间球海胆饥饿代谢研究

于 2 0 0 2年 4月至 5月测定了饥饿状态下中间球海胆 (Strongylocentrotusintermedius)耗氧率和排氨率的变化情况 ,得出海胆饥饿后耗氧率、排氨率及氧氮比变化曲线 ,并对海胆性腺主要成分进行组织化学分析。结果表明 :随饥饿时间的延长 ,中间球海胆的耗氧率呈“稳定、急速下降、再稳定”的阶段性变化 ,在整个饥饿期间内下降了 4 5 .6 % ;排氨率经短暂稳定后 ,先上升再阶段性下降 ,实验结束时共下降了 32 .33% ;氧氮比则表现出平稳、下降、上升的趋势。组织化学的测定结果是海胆饥饿前后性腺的主要变化成分为蛋白质和糖类 ,综上可认为 ,海胆饥饿后能源物质利用顺序为 :蛋白质 糖类、蛋白质、蛋白质 糖类