蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

半夏RAPD分子标记反应体系优化

从半夏中提取基因组DNA作为模板进行RAPD反应的优化试验,获得RAPD-PCR扩增反应的最佳条件:25μL体系中Mg2+1.5 mmol/L;dNTPs各0.2 mmol/L;模板DNA100 ng;引物0.25μmol/L;Taq酶活性值1.0 U。     

柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选

以柱花草奥克雷品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化,建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明:20μL为最佳反应体系,酶切体系中DNA模板量为1000ng,用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳;分别取5μL酶切液、1μL T4连接酶(5μL/L)、1μL EcoR I接头、1μL Mse I接头、2μL缓冲液(T4DNA酶自带),于22℃下连接10 min效果最佳;预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75 mmol/L、Taq酶用量为1 U、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为2 ng/μL效果最佳;选择扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25 mmol/L、Taq酶为1 U、dNTPs浓度为0.225 mmol/L、引物浓度为0.4 ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选,筛选出46对引物组合,为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。     

大葱RAPD反应体系的优化

研究了大葱基因组DNA的提取方法,并对Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了RAPD最佳反应体系,即20μl反应体系中10×Buffer缓冲液2μl,Mg2 浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度0.22 mmol/L,引物浓度0.65μmol/L,Taq酶1 U(2.5 U/μl),模板DNA 60 ng,用灭菌超纯水补足20μl。扩增程序为:94℃预变性3 m in;94℃变性40 s,38℃退火45 s,72℃延伸1 m in,40个循环;最后72℃延伸10 m in。     

牡丹SRAP反应体系的建立及正交设计优化

采用L16(45)正交试验设计,对牡丹SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的Mg2+浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度5因素4水平正交优化,建立了适合于牡丹基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs为0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.4μmol/L,模板DNA 1.0 ng/μL,总体积20.0μL。     

桃甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术体系的建立

为建立适合桃的甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,简称MSAP)反应体系,以桃PCM-1R、PCM-1G为材料,对MSAP技术中的关键因素进行优化。结果表明,500 ng基因组DNA用EcoRⅠ、HapⅡ或MspⅠ各10 U(0.5μL,2 000 U/m L),37℃保温12 h,即可酶切完全;25μL选择性扩增体系中,含有2μL10倍稀释的预扩增产物、各1μL上下游引物、2.5μL 10×Taq buffer、2.5μL d NTP mix(各0.2 mmol/L)、2.5μL25 mmol/L MgCl_2、0.25μL Taq DNA聚合酶。在该体系下选用256对引物对桃叶片进行甲基化模式分析,经筛选获得23对扩增条带清晰、重复性好的引物,PCM-1R、PCM-1G总甲基化率分别为28.0%、25.7%。     

鼠尾草属植物基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

以鼠尾草属植物叶片为材料,提取基因组DNA,并对RAPD反应条件进行了系统优化.结果表明,采用核DNA法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为20μl反应体系中,10×buffer 2.0μl,模板DNA 20 ng,Mg 浓度2.0 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,dNTPs浓度0.2mmol/L,Taq酶1.0U.扩增反应程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1main,72℃延伸2main;40个循环;72℃后延伸10main,4℃保存.     

玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

甜柿SSR扩增反应体系的建立

本试验采用正交试验设计法,对"阳丰"甜柿SSR-PCR体系中DNA模板浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、引物、Taq酶用量等进行了优化,通过琼脂糖凝胶电泳对谱带进行分析,结果表明体系10为最佳体系:20μL扩增反应体系中,25mmol·L-1 MgCl2溶液1.4μL,10 mmol·L-1 dNTPs混合液0.4μL,10 mmol·L-1引物1.1μL,5U·μL-1 Taq酶液0.4μL,10ng·μL-1 DNA溶液4.0μL。所有参试因素中Taq酶对"阳丰"甜柿SSR-PCR扩增结果影响最大,dNTPs对PCR结果影响最小。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

Study on DNA Cytosine Methylation of Cotton （Gossypium hirsutum L.） Genome and Its Implication for Salt Tolerance

To study the relations between DNA methylation and abiotic stress responses in cotton （Gossypium hirsutum L.）,the methylation-sensitive amplified polymorphism （MSAP） method was used to investigate the differences in methylation level and the change of cytosine methylation patterns under salt （NaCl） stress in two different salt-tolerant cotton lines.The results showed that the number of the cytosine methylation of CCGG sites in high salt-tolerant cotton line was less than that in low salt-tolerant line.Under salt stress,extensive cytosine methylation alterations including hypermethylation and demethylation as well as the potential conversion of methylation types occurred in the salt-treated cotton line compared with the corresponding control.Interestingly,salt stress-induced demethylation loci that occurred in high salt- tolerant cotton line were greater than those in low salt-tolerant cotton line,however,salt stress-induced hypermethylation loci in the high salt-tolerant cotton line were less than those in low salttolerant cotton line.It suggested that the demethylation positively contributed to salt tolerance and the hypermethylation had negative effect on salt tolerance in cotton.     

NaCl胁迫对黄瓜种子萌发的影响及DNA甲基化的MSAP分析

【目的】研究黄瓜种子萌发过程中DNA甲基化动态变化情况以及外源施加NaCl对种子萌发及种子DNA甲基化水平的影响,探索DNA甲基化在黄瓜种子萌发过程及NaCl胁迫反应中的作用。【方法】运用甲基化敏感扩增多态性（methylation se nsitive amplified polymorphism,MSAP）技术,分析0、150、200 mmol•L-1 NaCl处理下,黄瓜种子萌发过程（0、1、2、4、6、8 d）的DNA甲基化水平及动态变化情况。【结果】MSAP结果显示,黄瓜种子CCGG位点的甲基化水平约15.25%,以双链甲基化方式为主。种子中DNA甲基化水平在萌发1—2 d略有升高,而在整个萌发过程中呈下降趋势;NaCl处理加剧了甲基化的变化幅度,并使萌发末期的甲基化水平更低。萌发过程中甲基化升高和降低同时发生,分别在不同萌发时期占主导,不同变化类型中CG/CHG（H=A,T,C）位点胞嘧啶甲基化同时变化的类型占主导。甲基化变化同时发生在编码序列和非编码序列中。【结论】黄瓜种子萌发过程的DNA甲基化表现出复杂性,甲基化和去甲基化进程同时进行,并具有时空特异性。NaCl处理降低了种子基因组甲基化水平的稳定性,对种子萌发有抑制作用。     

生物体砷代谢解毒机制的研究进展

近年来砷污染问题引起了世界各地的广泛关注,砷通过地下水饮用、食物链传递进入人体,对人体产生伤害。因此,必须采取措施控制砷进入动植物和人体的数量,改变砷在生物体内的赋存形态,从而降低砷对人体产生的毒害。本文综述了砷在生物体内的基本代谢过程;砷代谢过程中的关键酶：砷酸盐还原酶、亚砷酸甲基转移酶的结构及功能。通过调控砷代谢过程中的关键酶活性,可改变砷在生物体内的形态配比和毒性,从而降低砷对人体产生的健康风险。     

柯乐猪血液基因组甲基化修饰与细胞因子水平的相关性

为探明柯乐猪血液免疫细胞的基因表达是否受甲基化调控,应用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和酶联免疫吸附测试技术(ELISA)对柯乐猪与大白猪血液基因组DNA的甲基化水平、血清中的细胞因子浓度进行检测,分析柯乐猪与大白猪在甲基化水平、细胞因子浓度方面的差异及其相关关系。结果表明:柯乐猪基因组总甲基化水平为32.38%,与大白猪接近(P0.05);IL-2、IL-4、IL-6和IL-10浓度分别为(302.37±125.72)pg/mL、(88.71±32.05)pg/mL、(219.01±30.42)pg/mL和(116.95±30.24)pg/mL,其中IL-6和IL-10分别极显著、显著低于大白猪;IFN-α、IFN-γ分别为(211.09±76.08)pg/mL和(57.18±14.21)pg/mL,分别极显著、显著高于大白猪。柯乐猪基因组的全甲基化水平与IFN-γ浓度间呈弱负相关关系(ρ=-0.256)。说明,血液免疫细胞的基因表达可能受甲基化的调控,且与柯乐猪的抗病力强有关。     

水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析

 【目的】研究水稻抗旱导入系DK106和旱敏感轮回亲本IR64苗期和分蘖期干旱胁迫前后DNA甲基化的变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化特征,探讨DNA甲基化在水稻干旱胁迫反应中的作用。【方法】用甲基化敏感扩增多态性技术（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）和高效液相层析（high performance liquid chromatography,HPLC）方法分析DNA甲基化变化情况;从聚丙烯酰胺凝胶回收甲基化多态性片段并克隆测序及序列比对。【结果】MSAP分析结果显示,水稻基因组中约有20%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化;水分胁迫导致DNA甲基化平均水平明显增加,其中根部增加幅度尤为明显;DNA甲基化水平及状态变化在品种间存在差异,同时具有时期及组织特异性。对干旱胁迫特异诱导DNA甲基化片段序列分析结果表明,基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相同。【结论】干旱胁迫反应过程中DNA甲基化表现出一定时空特异性和品种特异性,且与品种抗旱性差异相关。     

莆田黑猪不同组织DNA甲基化的MSAP分析

为研究莆田黑猪不同组织间基因组DNA甲基化水平差异及各组织甲基化水平在不同生长发育阶段之间的变化规律,采用甲基化敏感扩增片段多态性(MSAP)方法检测了1、25和210日龄莆田黑猪的心脏、肝脏、肌肉、脂肪、耳和尾6个组织基因组DNA的甲基化水平.结果表明:心脏和肝脏组织的甲基化水平随日龄增长呈下降趋势,且日龄间的甲基化水平差异显著(P0.05);25日龄肌肉组织的甲基化水平与1日龄的差异不显著(P0.05),但显著高于210日龄(P0.05);25日龄脂肪和耳组织的甲基化水平显著高于1和210日龄(P0.05);3个日龄间尾组织的甲基化水平差异不显著(P0.05);3个日龄的肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间的甲基化水平均存在显著差异(P0.05),表明DNA甲基化在肝脏与脂肪组织之间、肝脏与耳组织之间存在组织特异性.     

猪血液和肌肉组织DNA甲基化含量的测定

 摘要: 【目的】通过测定纯种亲本大白猪、长白猪、梅山猪及其正反交大白猪×长白猪、长白猪×大白猪、大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪等杂种猪血液和肌肉组织DNA甲基化含量，分别比较基于不同杂交组合和不同组织，亲本与子代之间在DNA甲基化含量上的差异,为揭示杂种优势的分子机制提供依据。【方法】采用高效液相色谱法测定血液和组织中甲基化含量。【结果】经过测定及计算，163份肌肉组织样平均甲基化含量为16.92%；182份血液样平均甲基化含量为6.49%，两者之间差异达到了极显著水平（p<0.01）。在相同组织不同杂交组合中杂种后代表现不同。同样地，在相同杂交组合不同组织之间杂种后代表现也不尽相同。【结论】杂种甲基化含量升高，可能是利用甲基化关闭了一些影响生长的不利基因的表达。杂种甲基化含量的变化表现为杂交组合和组织特异性。     

草莓解除休眠过程中DNA甲基化变化研究

为了研究DNA甲基化对草莓休眠的影响,进一步阐明草莓休眠的机制,在温度5℃、光照8h处理条件下对全明星和达赛莱克特2个草莓品种进行休眠解除,研究在此过程中总DNA甲基化水平及相关基因表达变化。结果表明,在解除草莓休眠过程中,2个草莓品种新展开叶片中总DNA甲基化水平均降低。甲基转移酶FaDRM(domain-rearranged methyltransferase)基因在2个草莓品种中保持较低表达水平。转葡萄糖基酶FaROS1(repressor of silencing 1)基因在全明星和达赛莱克特中分别从第4周和第3周开始显著上调表达,FaROS1基因的上调表达可能是引起DNA甲基化水平降低的原因之一。     

植物DNA甲基化研究进展

[目的]概述植物DNA甲基化的研究进展。[方法]综述了植物DNA甲基转移酶s、iRNA指导的DNA甲基化过程,阐明了DNA甲基化与其他表观遗传修饰的关系。[结果]DNA甲基化在表观遗传控制体系中起着重要作用,维持着生物进化过程中基因组和表观遗传的稳定性。RNA介导的DNA甲基化作用中s,iRNA起着不可替代的作用,但RdDM和甲基化在基因调控中的作用需要更进一步研究。[结论]全面了解DNA甲基化及其在植物发育和逆境胁迫应答中的作用,可以在转录水平上增强或抑制外源基因和内源基因沉默,便于制定更合理的改良重要转基因作物的策略。     

甲基化EGCG的合成及其在人工模拟胃肠液中的稳定性

以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为原料,用硫酸二甲酯对其进行部分甲基化.甲基化产物经乙酸乙酯萃取,再经硅胶柱、凝胶柱和反相硅胶柱分离得到EGCG的甲基化衍生物,再经ESI-MS,MS/MS和1HNMR鉴定.利用高效液相色谱技术测定分离到的甲基化EGCG和EGCG在人工模拟体胃液与肠液中的变化.结果表明,该体系合成甲基化EGCG的最佳务件是:硫酸二甲基酯与EGCG的摩尔比1∶1,在60℃水浴条件下回流反应5h.通过分离,最后得到纯度为93.86%的单甲基化产物242 mg,得率约为9%,经鉴定其结构为EGCG4"Me.在人工模拟胃液中,EGCG4"Me脱去甲基,生成EGCG,起到缓释作用;而在人工模拟肠液中,EGCG4"Me由于甲基化,稳定性提高.