山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。     

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。     

中国野生葡萄醛脱氢酶基因在拟南芥中的过量表达

将质粒pWR306中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1300,构建了植物中间表达载体pWR-II;将重组质粒pGEM-T-ALDH的醛脱氢酶(ALDH)基因片段定向克隆到pWR-II,构建了葡萄ALDH基因的植物过量表达载体pWR-II-ALDH。采用改进冻融法将其导入农杆菌EHA105,采用花序浸蘸法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性的转化拟南芥植株。PCR检测证明外源基因已整合进拟南芥基因组,Real-timePCR结果表明ALDH基因在转化植株的表达量远高于野生种。转化植株和野生植株在形态上有一定的差异,说明葡萄ALDH基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。     

“联农带民”来创业

单打独斗？抱团创业？合作方式千万种,创业你打算怎样干？在江苏省金湖县,几位大学生村官将农村大户的资金、管理经验,合作社的市场渠道等与自己的开拓能力以及专业知识结合起来,＂联农带民＂多途径创业,真正将创业的带动作用发挥得淋漓尽致。     

山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山–1’叶片组织为试材，通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库，库容量为1.36×10⁷ cfu·mL^-1，外源基因插入片段均大于1 kb，重组率为100%，符合后续试验要求。以VaMYB4a^113-252C端调控区段为诱饵，经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白，选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证，发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a^113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析，推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系，进而通过BiFC验证表明，VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作；顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件，其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE)；低温胁迫下，VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5...     

基于转录组研究光质对转色期红地球葡萄果实着色及品质的影响

[目的]探讨不同光质对设施红地球葡萄果实着色及品质的影响,并从中挖掘出关键的光调控基因.[方法]以8年生红地球葡萄为试验材料,采用4种不同光质(红蓝光2∶1、蓝光、红光、白光)补光处理设施红地球葡萄,以不补光为对照,对果实中花青素、还原糖、可滴定酸和可溶性固形物含量进行测定,并对果皮进行转录组测序.[结果]不同光质处理下果实中花青素、还原糖和可溶性固形物含量均高于对照,其中在蓝光处理下最高.利用FPKM计算基因表达量,以差异表达倍数| log2fold changes|≥1,P-adjust＜0.05为筛选条件,共获得1313个差异表达基因,包括上调基因728个,下调基因585个,其中红蓝光、蓝光、红光、白光处理与对照之间的差异基因数目分别为638、434、375和320个.GO分析发现差异基因与代谢过程、细胞过程、膜、催化活性、结合等条目密切相关.KEGG分析发现不同光质通过调控葡萄光合作用、类黄酮生物合成、淀粉和蔗糖代谢等相关基因表达进而影响葡萄果实着色及品质.根据富集结果选取9个差异表达基因,经qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组测序结果一致.[结论]不同光质补光均能改善葡萄果实的着色及品质,其中以蓝光的效果最为明显;葡萄果实中类黄酮基因CHS、F3H及淀粉和蔗糖代谢基因INV、SPS、HK和BG的差异表达,是导致各处理葡萄果实着色及品质差异的重要原因.     

水分胁迫对葡萄果实白藜芦醇合成相关基因表达的影响

为探究水分胁迫对葡萄果实白藜芦醇合成的影响,本研究以赤霞珠为试验材料,对其进行不同程度水分胁迫处理,测定葡萄果实白藜芦醇含量及白藜芦醇生物合成相关基因表达量。结果表明,葡萄果实进入转色期,PAL、4CL、STS基因随白藜芦醇合成而大量表达;不同水分胁迫处理均能增加葡萄果实白藜芦醇含量,同时提高白藜芦醇合成相关基因的表达量,不同水分胁迫处理间存在差异;水分胁迫对果实转色前期和后期PAL、STS基因表达的促进作用最为显著,但水分胁迫显著降低了CHS基因的表达量。相关性分析表明,白藜芦醇含量与PAL、STS基因的表达量呈显著正相关,表明水分胁迫主要通过诱导PAL、STS基因表达来增加果实白藜芦醇含量。本研究结果为进一步阐明葡萄白藜芦醇合成调控机制奠定了理论基础。     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记的克隆及序列分析

对获得的中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记OPW02-1756、OPO11-964、OPY13- 661、OPB11- 520、OPW05-766、OPV03-1365和OPJ16-759进行了回收、克隆、测序及序列分析。结果表明,7个RAPD标记的实际长度分别是1756bp、964bp、661bp、520bp、766bp、1365bp和759bp。OPW02-1756序列与3条欧洲葡萄cDNA克隆获得的EST序列有94 ~ 98%的同源性。OPO11- 964序列与欧洲葡萄“赤霞珠”的1条EST序列有93%同源性,与“霞多丽”的2条果实不同发育时期获得的EST序列有90%和87%的同源性,与甜橙在多种病原菌侵染后通过cDNA文库获得的1条EST序列有83%的同源性。OPO11-964最大的一个阅读框架包含444个碱基,编码147个氨基酸,该氨基酸序列和21个其它生物的未知功能蛋白序列有部分相似性。OPY13-661序列与欧洲葡萄16条EST序列有同源性,其中与“赤霞珠”cDNA克隆的EST有较高的同源性, 与“霞多丽”的2条叶片非生物胁迫有关的EST序列同源性均为89%。OPB11-520序列与拟南芥基因组4条未知功能DNA序列有94%同源性。OPW05-766序列与来自于酿酒葡萄的GAG-POL 前提有50%的同源性。OPV03-1365序列与水稻基因组6条序列有81 ~ 88%的同源性,与拟南芥基因组3条序列有84 ~ 91%的同源性。OPJ16-759与欧洲葡萄“霞多丽”叶片14条非生物胁迫EST序列有83 ~ 100%的同源性,与欧洲葡萄“Cabsau”浆果3条水分胁迫的EST序列有94 ~ 100%的同源性。     

褪黑素对‘无核白’葡萄体细胞胚的诱导作用

以欧洲葡萄‘无核白’（Vitis vinifera‘Thompson Seedless’）未开放的小花蕾为外植体，研究0、1.0、2.0、3.0 mg ? L-1褪黑素（Melatonin）对其体细胞胚的诱导效果。结果表明：‘无核白’小花蕾在 MS + 1.0 ~ 3.0 mg ? L-1 褪黑素 + 2.0 mg ? L-1 6-BA + 30 g ? L-1蔗糖 + 3 g ? L-1植物凝胶的培养基上继代培养30 d时愈伤组织诱导率较好，为73.67% ~ 89.10%，显著高于2,4-D处理，愈伤组织形成所用时间较2,4-D处理缩短了14 d。愈伤组织诱导120 d时，不同浓度褪黑素均出现体细胞胚，其中，以MS + 1.0 mg ? L-1褪黑素 + 2.0 mg ? L-1 6-BA + 30 g ? L-1蔗糖的培养基体细胞胚的发生率最高，180 d时达12.05%。体胚在 MS + 60 g ? L-1 蔗糖 + 0.5 g ? L-1活性炭的X6培养基中萌发30 d后，将萌发的子叶胚转移至MS + 0.2 mg ? L-1 6-BA + 0.1 mg ? L-1 NOA + 30 g ? L-1 蔗糖 + 0.5 g ? L-1活性炭的成苗培养基上，其中，1.0 mg ? L-1褪黑素诱导产生的体胚发育正常的数量较多，为14.84%。不同浓度褪黑素处理的体胚诱导率均于180 d后增长较快，且低浓度的褪黑素有利于体胚萌发与正常发育，2,4-D诱导的愈伤组织无体胚形成。