华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析

以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。     

甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析

本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖.     

猪多潜能性维持因子5 cDNA全序列的克隆与分析

利用前期筛选出的一些与母猪妊娠相关的有价值的新候选基因,选取其中一个位于网络顶端的EST序列(CK455976),根据此EST序列设计引物,以母猪卵巢为材料提取总RNA,运用RT-PCR和RACE-PCR对其进行cDNA全序列克隆,得到多潜能性维持因子5(developmental pluripotency associated 5,DPPA5)基因cDNA全长596 bp,提交GenBank数据库,登录号为FJ436413.经序列分析发现,其中5'UTR长67 bp,3'UTR长175 bp,编码区长354 bp,编码117个氨基酸.同源性比对分析发现,该基因核苷酸序列与人、小鼠、猕猴和狗的DPPA5基因同源性分别为83%、70%、83%和80%;编码的氨基酸序列同源性分别为74%、55%、74%和69%.经生物信息学分析,预测出DPPA5的相对分子量约13.60 kD,等电点5.24,在约1～10、18～29、38～51、60～66和75～110位之间氨基酸存在亲水性区域,DPPA5蛋白主要存在于细胞膜外侧.     

小麦品种小偃22干旱诱导基因及其表达分析

利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了小麦(Triticum aestivum)品种小偃22干旱胁迫诱导基因表达的SSH-cDNA文库,从文库中随机挑选插入片段大于400 bp的阳性克隆60个进行测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得了31条高质量表达序列标签(EST)序列(GenBank登录号:ES466737～ES466766,ES466799).进一步采用RT-PCR对其中的胚胎形成晚期富集蛋白基因(LEA)和△1-吡咯啉-5-羧基合成酶基因(P5CS)的表达模式进行了分析.结果表明,获得的EST序列中的26条EST序列具有功能已知的同源基因,这些基因多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,表明植物在胁迫反应中有明显的交叉适应性,其中与小麦表达序列高度同源的EST占58%.24条EST序列与功能已知蛋白的同源性较高,主要涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控及防卫反应等.表达模式分析表明,LEA家族蛋白D9在土壤绝对含水量达到4.8%时上调表达,在萎蔫后复水2 h时表达量最高,随着复水时间延长表达量降低并趋于稳定;PSCS基因D16在渍水条件下、严重干旱胁迫下均上调表达,而在可维持生长的水分条件下和严重干旱后复水4 h后表达量急剧下降.序列分析表明,LEA蛋白基因D9与PSCS基因D16均是部分同源基因,暂命名为TaLEA-D9和TaP5CS-D16.     

陕229干旱复水诱导基因表达及小麦乙烯受体(TaERS)基因特征分析

为了解小麦响应水分胁迫后复水条件下的基因表达特征,以小麦(Triticum aestivum L.)主栽品种陕229的3叶1心期幼苗为材料,采用消减杂交技术,构建了干旱复水条件下的SSH-cDNA表达文库。从消减文库中随机挑选59个插入片段大于400bp的阳性克隆测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得高质量EST序列32条(GenBank登录号为ES466767~ES466798)。序列比对分析表明,小麦干旱后复水的基因表达与植物对其他非生物胁迫的响应具有交叉性;17条EST序列与已知编码蛋白的基因同源性较高,涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控等方面;其他序列为新的EST。以其中一个与乙烯受体基因(ERS)同源性较高的EST序列为基础,采用同源克隆及RACE技术从小麦中分离了4个乙烯受体基因的全长cDNA序列,长度分别为2090、2271、2216和1886bp。4个全长cDNA序列所编码氨基酸序列的同源性极高(99%以上),且均具有ERS典型的GAF、HisKA和HATPase-c跨膜结构,分别命名为TaERS1(HM347272),TaERS2(HM601437),TaERS3(HM601438)和TaERS4(HQ111523)。植物ERS氨基酸序列多重比较表明,小麦与水稻的相似性最高(93%);TaERS基因的全长cDNA序列间比较共发现SNP位点23个。定量PCR表达分析显示,小麦TaERS家族基因参与了小麦植株响应水分胁迫和复水的调控机制。研究结果有助于进一步认识小麦干旱后复水的基因表达谱和小麦水分高效利用机制,探索小麦乙烯受体在水分高效利用中的作用。     

银杏EST序列中微卫星的分布特征

本文利用从NCBI下载的21590条银杏EST序列,分析了银杏（表达序列标签微卫星）EST-SSR在银杏EST序列的分布和比较了在不同长度EST序列中的SSR特性。在剔除冗余和低质量序列后,得到总长为5708.385kb的无冗余EST序列7961条,发现了405个EST序列（5.09%）含有475个SSR,长度400~1000bp的EST序列含SSR位点数为445个,占SSR总数的93.68%。二核苷酸和三核苷酸基元类型是银杏EST-SSR的主要类型,分别占SSR总数的73.89%和24.00%,最常见的SSR基元是：（AT）n、（AG）n、（AC）n、（AAG）n和（AAT）n。通过对银杏EST序列中SSR位点信息的发掘分析,为有针对性地设计EST-SSR引物,开发银杏EST-SSR分子标记奠定基础。     

N+离子注入陆地棉花粉对胚珠DNA及M1代cDNA表达的影响

通过对胚珠DNA的SSR标记分析,在DNA水平上检测氮离子束诱变后胚珠的多态性变化,结果表明,离子注入陆地棉花粉后再给雌蕊授粉,会对胚珠的DNA多态性产生影响,表明在一定程度上改变了花粉中精细胞的DNA序列;利用抑制性消减杂交(SSH)分离N+离子诱变花粉和对照正常花粉分别给雌蕊授粉后产生的M1代植株叶片间表达有差异的cDNA片段,建立差异表达cDNA文库。已测序的有50个缩减cDNA克隆,根据BLAST网络服务检索查询EMBLGen、 Bank、DDBJ和PDB的核苷酸序列数据库以及蛋白质氨基酸序列数据库,进行序列联配,结果发现52%序列在数据库中都有同源的棉属来源的EST。38个EST与其他物种已知基因部分区域的同源性为56%-100%,占总EST的76%;5条EST序列能在数据库中检索到同源性序列,但其功能（占10%）尚不清楚;9个EST能在数据库中发现为推测蛋白,占18%;4个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列,占8%。     

利用EST数据克隆大豆天冬氨酸代谢途径关键酶基因

电子克隆（in silico cloning）是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。本研究根据物种间同源基因相对保守的特点，利用生物信息学方法以不同物种的基因序列为信息探针，运用Blast软件与所下载的大豆EST数据库进行比对拼接，获得基因全长cDNA序列。首次克隆了大豆天冬氨酸代谢途径上AHRI、AHAS、ASADH、BCAT、CBL、DAPD、DAPE、DHDPR、DHAD、HK和TD等11个关键酶基因的cDNA序列。其中AHRI、DAPD、DAPE、DHDPR和DHAD基因经RT—PCR克隆和序列分析验证，长度分别为1764bp、1467bp、1080bp、1035bp和1806bp，结果与电子克隆序列基本一致。本实验通过与不同物种的这些基因蛋白序列比较，发现与双子叶植物拟南芥、蓖麻和马铃薯的同源性较高，而与单子叶植物水稻的同源性略低。     

利用EST序列鉴定葡萄应答外源赤霉素的基因

为了利用NCBI上大量的葡萄(Vitis viniferaL.)EST序列进行葡萄应答外源赤霉素基因的信息挖掘,通过本地化Blast、Blast2go等工具以及其他生物信息学工具和数据库,对NCBI上经过赤霉素(gibberellins,GA)诱导后的葡萄EST序列进行处理,获得了45条仅在赤霉素处理后表达的无冗余EST序列。Blastx注释结果显示,45条序列中有25条序列注释为假定蛋白或未知蛋白(约占55.6%),14条序列无注释信息(约占31.1%),6条序列(13.1%)注释有推定功能,其中包括整合酶蛋白(EE077049)、SPX结构域基因1(EE085000)、丝氨酸羧肽酶类44蛋白(EE091188)、CHY1(EE092187)、假尿苷合酶/转运蛋白(EE106096)、钾离子通道蛋白(EE108944)。Blast2go分析显示,共有29条序列通过基因本体论(GO)注释180个GO号,分属于分子功能(molecula rfunction)、细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)三大类的不同水平。初步推断,在外源赤霉素对葡萄进行处理后,应答基因主要具有结合活性(46.34%)和催化活性(39.02%)两方面的分子功能。其作用空间分布为整个细胞(44.68%)或者细胞器(40.43%)中,并且主要通过参与细胞生理过程(28.57%)和代谢过程(25.71%)等一系列复杂的生理生化反应完成整个应答过程。为进一步研究赤霉素处理后导致葡萄的基因表达情况提供了基本资料。     

棕色棉类黄酮3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及色素合成途径中相关基因表达特性研究

为探讨花色苷途径在彩棉色素形成中的作用及彩棉色素形成规律,本研究根据葡萄(Vitis vinifera)的类黄酮3'-羟化酶(flavonoid3'-hydroxylase,F3'H)基因全长cDNA序列blast所得棉花(Gossypium hirsutum)的EST序列(GenBank登录号:DT545210,CO071403和BG447485)设计引物,以开花后16d的新彩棉5号(XC-5)纤维为材料,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RT-PCR方法分离得到了2个类黄酮3'-羟化酶基因的全长cDNA序列,长度为1761和1892bp,均含有一个97~1629bp、长度为1533bp的开放阅读框,编码510个氨基酸,将这两个序列命名为GhF3'H-1和GhF3'H-2,分别提交GenBank,登录号为HM598123和HM598124,此2个序列编码区完全相同,仅在3'非翻译区(UTR)存在片段长短的差异。半定量RT-PCR检测花色苷合成途径中查尔酮合成酶(chalcone synathase,CHS)基因、F3'H、类黄酮3',5'-羟化酶(flavon...     

Gene families encoding isoforms of two major sesame seed storage proteins, 11S globulin and 2S albumin

Sesame (Sesamum indicum L.) seed has been recognized as a nutritional protein source owing to its richness in methionine. Storage proteins have been implicated in allergenic responses to sesame consumption. Two abundant storage proteins, 11S globulin and 2S albumin, constitute 60-70 and 15-25% of total sesame proteins, respectively. Two gene families separately encoding four 11S globulin and three 2S albumin isoforms were identified in a database search of 3328 expressed sequence tag (EST) sequences from maturing sesame seeds. Full-length cDNA sequences derived from these two gene families were completed by PCR using a maturing sesame cDNA library as the template. The amino acid compositions of these deduced storage proteins revealed that the richness in methionine is attributed mainly to two 2S albumin isoforms and partly to one 11S globulin isoform. The presence of four 11S globulin and three 2S albumin isoforms resolved in SDS-PAGE was confirmed by MALDI-MS analyses. The abundance of these isoforms was in accord with the occurrence frequency of their EST sequences in the database. A comprehensive understanding of these storage proteins at the molecular level may also facilitate the identification of allergens in crude sesame products that have caused severe allergic reactions increasingly reported in the past decade.     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼SRY基因同源克隆和序列分析

采用人SRY基因保守序列的特异性引物，对奥利亚罗非鱼（Orcocbromis aureus）和尼罗罗非鱼（O．nilotica）雌、雄个体基因组进行PCR扩增，回收其中的600bp片段，分离克隆并双向测序。用DNAStar分析比较所得序列，表明克隆的600bp片段为SRY基因的同源序列。对两种罗非鱼雌、雄个体SRY同源序列进行多序列比较分析（CLUSTAL W分析），表明罗非鱼间SRY同源序列的相似性非常高，但仍存在性别间、种间差异。奥利亚罗非鱼雌、雄间序列相似性为99．5％，尼罗罗非鱼雌、雄间为99．5％，奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼种间则为98．7％，罗非鱼与人类SRY基因间只有7．1％，结果为进一步研究罗非鱼SRY同源基因与性别决定的关系提供了可能性。根据这些结果构建了罗非鱼系统分类树，表明奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼具有很近的亲缘关系。     

Isolation and Analysis of Genes Induced by Rehydration after SeriousDrought in Broomcorn Millet (Panicum miliaceum) by Using SSH

利用抑制消减杂交(suppression subtraction hybridization，SSH)技术构建了糜子(Panicum miliaceum)干旱后复水条件与正常浇水条件下基因差异表达的SSH-cDNA文库。对其中的60个阳性克隆进行了测序，在去除冗余的cDNA后，利用NCBI的BLAST软件在GenBank 中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。核酸比对结果表明,有32个cDNA片段与已知cDNA片段具有较高的同源性，且多数与植物受到生物或非生物胁迫时的反应机制相关，同时有11条序列与小鼠肝被手术切除后再生时产生的EST有一定同源性。蛋白分析结果显示，有28个序列与已知功能蛋白序列同源性较高，这些功能蛋白涉及植物体内的信号转导、转录调控及蛋白加工等。实验结果表明糜子在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达。     

花生果种皮发育相关特异基因的克隆和表达分析

本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。     

Production of conjugated linoleic acid (CLA) by Bifidobacterium breve LMC520 and its compatibility with CLA-producing rumen bacteria

This study was performed to characterize the ability of an active Bifidobacterium strain to produce conjugated linoleic acid (CLA) and to test its possible utilization as a probiotic compatible to the ruminal condition. Bifidobacterium breve LMC520 can actively convert linoleic acid (LA) to cis-9,trans-11-CLA, which is a major isomer derived from microbial conversion. LMC520 showed reasonable tolerance under acidic conditions (pH 2.5 with 1% pepsin) and in the presence of oxgall (0-3%). The growth and CLA production of LMC520 were tested under ruminal conditions and compared with those of Butyrivibrio fibrisolvens A38, which is a major CLA producer in the rumen as an intermediate in the biohydrogenation (BH) process. LMC520 converted 15% of LA to CLA under ruminal conditions, which was 2 times higher activity than that of A38, and there was no decline in CLA level during prolonged incubation of 48 h. The BH activity of LMC520 was comparable to that of A38. When LMC520 was cocultured with A38, even with slight decrease of CLA due to high BH activity by A38, but the level of CLA was maintained by the high CLA-producing activity of LMC520. This comparative study shows the potential of this strain to be applied as a functional probiotic not only for humans but also for ruminants as well as to increase CLA production.