中国野生葡萄芪合成酶基因融合表达、纯化及多克隆抗体制备

根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

鸡肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)抗血清制备及组织表达特性分析

制备鸡(Gallus gallus)肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)的多克隆抗血清,并分析L-BABP的组织表达特性.利用RT-PCR扩增L-BABP基因的CDS区,构建鸡L-BABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T/L-BABP.将重组表达质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导后产生GST/L-BABP融合蛋白,利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST/L-BABP融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清.诱导得到了1个38 kD(12 kDL-BABP+26 kD GST)的融合蛋白,经间接ELISA方法测定制备的抗血清效价为1:100 000.利用此抗血清分析鸡L-BABP的组织表达特性,结果表明该基因仅在肝脏组织中特异性表达,在肾、肺、腿肌、腺胃、胸肌、心脏、脂肪、脾、回肠、肌胃、空肠和十二指肠等12种组织中没有检测到表达信号.本研究制备的高效价、高特异性的鸡L-BABP抗血清,为从蛋白水平上深入研究L-BABP的生物学功能提供了良好的基础.     

小麦黄色花叶病毒外壳蛋白基因E.coli表达产物特异性抗血清的制备及其应用

将小麦黄色花叶病毒（wheat yellow nosaic virus,WYMV)外壳蛋白克隆到pET-30a( )上,获得E.coli表达载体pETWCP。SDS－PAGE和Western blotting分析结果表明,pETWCP在E.coli中经IPTG诱导后,可特异地表达38．5kD的融合蛋白,光密度扫描分析结果,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的40％。以诱导表达产物作为抗原,免疫家兔制备了特异性强的抗血清,用微量沉淀法测其效价为1：1024。该抗血清可替代常规病毒粒子抗血清,用于酶联免疫吸附测定,免疫电镜Western blotting检测WYMV。     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性初步研究

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因, 克隆至表达载体pET32a中, 构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化至感受态E. coli BL21(DE3) 中, 经IPTG诱导和SDS-PAGE 分析, 可见约42.4kDa 的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting 分析发现, 表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中, 利用His•Bind试剂盒获得纯化的蛋白, 将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠, 间接ELISA法测得抗体的效价, MTT 法检测免疫小鼠的T 淋巴细胞增殖反应能力。结果说明该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性

在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1.将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约42.4kD的目的蛋白以包涵体形式表达.Western blot分析发现,表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应.将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His-Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,间接ELISA法测得抗体的效价,MTT法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力.结果说明,该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫.     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

大麦白粉病抗性的遗传分析与QTL定位

为探究大麦白粉病抗性遗传,定位其抗性QTL,本研究以抗病品种Gairdner和感病品种扬饲麦1号杂交F₁花药培养构建的DH群体及亲本为材料,对大麦白粉病抗性进行鉴定与遗传分析,并利用91对在亲本间多态性好的SSR标记构建了群体的遗传连锁图谱,采用Windows QTL IciMapping 4.0软件中的完备区间-加性模型对大麦白粉病抗性QTL进行定位。结果表明,DH群体各系间存在丰富的大麦白粉病抗性遗传变异。共检测到5个与大麦白粉病抗性相关的QTLs。其中3个时期均检测到qPM-2Ha位于Bmag0711-AWBMS56区间,可解释的表型变异为7.48%~12.50%;qPM-4Ha位于EBmac0906-HVM68区间,可解释的表型变异为23.07%~32.09%;2个时期均检测到qPM-2Hb位于Bmag0749-GBM1475区间,可解释的表型变异为6.22%~8.13%。qPM-2Ha、qPM-4Ha及qPM-2Hb白粉病抗性基因均来源于抗病亲本Gairdner, qPM-3Ha和qPM-4Hb白粉病抗性基因来源于感病亲本扬饲麦1号,qPM-2Hb和qPM-3Ha可能是2个新的大麦白粉病抗性QTLs位点。本研究结果为大麦白粉病抗性基因的发掘、精细定位、克隆及分子标记辅助选择育种奠定了基础。     

含抗白粉病新基因普通小麦-黑麦1R二体异附加系的遗传学鉴定

黑麦（Secale cereale）含有丰富的优良基因,在小麦遗传改良中具有重要利用价值。为了鉴定普通小麦（Triticum aestivum）与奥地利黑麦杂交后代选育的抗白粉病品系N9436-1的黑麦遗传物质,对其进行了细胞学、基因组原位杂交、Giemsa-C分带、SCAR（sequence characterized amplified region）标记以及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分析。结果表明,N9436-1形态学和细胞学稳定,2n=44=22Ⅱ,对白粉病免疫,携带奥地利黑麦的多小穗性状。以奥地利黑麦总基因组DNA为探针的原位杂交结果及Giemsa C-分带显示,N9436-1含有2条奥地利黑麦的1R染色体, SCAR标记鉴定及A-PAGE分析进一步证实N9436-1携带有黑麦遗传物质,表明N9436-1携带的抗白粉病基因不同于Pm8和Pm17,是新的抗白粉病基因,可作为白粉病抗源用于小麦抗病育种。     

野生二粒小麦导入普通小麦抗白粉病基因MlWE27的鉴定和分子标记

由白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritci)引起的小麦白粉病是严重影响小麦安全生产的主要病害之一.本研究将来自以色列的野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)WE27的坏白粉病基因通过杂交和连续回交,导入普通小麦遗传背景中,育成高抗白粉病小麦新品系3D256(其系谱为燕大1817/WE27//农大015/3/941,F6).将3D256和高感小麦白粉病的普通小麦品系薛早配制杂交组合,对其F_1、F_2分离群体和F_3 家系进行白粉病抗性鉴定和遗传分析.结果表明,3D256携带抗白粉病显性单基因,暂命名为MlWE27.利用集群分离分析法(RSA)和分子标记分析,发现3个SSR标记(Xwmc243、Xwmc 154和Xbarc318)、1个EST-SSR标记(Xdp357)、1个AFLP转化的SCAR标记(XCAUG1)和1个RFLP探针转化的STS标记(XWG516-1)与抗白粉病基因MlWE27连锁,在连锁图上的顺序为Xdp357-Mlwe27-XCAUG1-XWG516-1-Xwmc243-Xwmc154-Xbarc318.利用中国春缺体-四体系、双端体系和缺失系将抗白粉病基因MlWE27定位于染色体2B短臂的末端Bin0.84-1.00上.这一普通小麦抗白粉病种质资源的创制及其连锁分子标记的建立为小麦抗病基因分子标记辅助选择、基因积聚和分子育种提供了新的物质基础.     

我国小麦农家品种和近缘种对白粉病的苗期抗性

由布氏白粉菌小麦专化型引起的白粉病是最重要的小麦叶部病害之一。抗性资源和抗性基因的发掘对控制该病害起了重要作用。小种专化抗性基因的抗性水平较高, 成为当前小麦生产上使用最为广泛的白粉病抗性基因。然而,这类抗性基因的广泛使用会导致菌系结构的改变, 并产生新的毒性小种。因此, 从大量小麦种质资源中鉴定新的、有效的白粉病抗性基因是一个长期的目标。为鉴定有效的白粉病抗源, 通过苗期接种国内流行白粉菌生理小种E09, 来评价258 份国内小麦农家品种和42 份小麦近缘种的抗性。结果表明, 有5份农家品种和20 份小麦近缘种对E09 表现免疫、近免疫或高抗。这25 份抗源被用来进一步接种另外5 个不同的国内生理小种E03、E05、E18、E20 和E23, 以推知它们所携带的未知抗性基因。通过与28 个已知白粉病抗性基因的抗谱进行比较发现, 这25 份小麦种质的抗性基因不同于Pm1a、Pm2、Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm3d、Pm3e、Pm3f、Pm4a、Pm4b、Pm4c、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm9、Pm17、Pm19、Pm24、Pm28 和Pm33等21 个已知抗性基因, 但与Pm1c、Pm1e、Pm12、Pm13、Pm16、Pm20 和Pm21 等7 个已知抗性基因仍需要进一步的区分。鉴于这25 份抗源与上述7 个已知抗性基因载体的来源不尽相同, 因此, 这些抗源很可能携带有未知的抗白粉病新基因, 但还需用更多的白粉菌生理小种来鉴定。本研究旨在从小麦农家品种及其近缘种中发掘新的有效抗源, 从而为抗白粉病新基因的发掘和有效利用奠定基础。     

Phenotypic diversity of barley powdery mildew resistance sources

One hundred and twenty-one of 123 previously detected new sources of wild barley (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) resistant to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. hordei), and originating from Mediterranean area, and 20 standards were tested at the seedling stage for reaction to 38 selected Israeli powdery mildew isolates. The obtained resistance spectrum (a set of resistant and susceptible reactions) of each accession was divided into triplets and converted to octal numbers. This concentrates information on the resistance phenotype of each accession and makes their comparison much easier. One hundred and thirty-four different resistance spectra were determined. No compatible reaction was found in standards possessing genes mlo and Mlhb2 and in the accession PI 466634. The results demonstrate large diversity in new resistance sources, their distinction from the sources described till now as well as diversity in powdery mildew resistance of wild barley in the Mediterranean area. The results facilitate more effective further studies of such a large set of new resistance sources, and contribute to speeding up their use in barley breeding.     

利用核辐射诱发小麦抗白粉病突变新种质

本试验采用不同剂量的γ射线、电子束、NaN_3与 EMS 处理3个小麦品种,在总剂量不变的情况下,用γ射线间歇辐照;用育种常用剂量(250～300Gy)辐照16个品种和12个杂种,诱发小麦抗白粉病突变,在 M_2进行苗期抗性突变体的筛选。结果表明,丁射线、电子束、NaN_3与 EMS 均为诱发小麦抗白粉病突变的有效诱变剂,而且电子束与 NaN_3的诱变效果更好。不同诱变剂诱发白粉病抗性的适宜剂量:丫射线300～350GV,电子束100～200Gy,NaN_31～3mmol/L,EMS 0.3%左右,品种间略有差异。γ射线间歇辐照较连续辐照的突变频率高,杂合材料较纯合材料的诱变效果更好。利用核辐射获得86份抗白粉病的中间材料。     

Analysis of Wheat Disease Resistance Data Originating from Screenings of Gatersleben Genebank Accessions during 1933 and 1992

Series of 10,348 accessions belonging to 21 species (hexaploid, tetraploid, diploid) of the genus Triticum and 489 accessions belonging to 20 species of the genus Aegilops were scored for disease resistance during a period of 60 years. Tests were performed at the seedling stage for powdery mildew (Erysiphe graminis DC. f. sp. tritici March.), leaf rust (Puccinia recondita Rob. ex Desm. f. sp. tritici Erikss.), stripe rust (Puccinia striiformis West. f. sp. tritici Erikss.) and eyespot (Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron.) Deight.) but also at the adult plant stage considering powdery mildew, leaf rust, stripe rust, eyespot and glume blotch (Septoria nodorum Berk.). About 150,000 disease scores recorded on index cards using different scoring scales were transferred to the computer, converted into a 1–9 scale and used to summarise the results. Within the genus Triticum 20% of the material analysed was classified as heterogeneous. For the accessions without detectable segregation a large variability for resistance/susceptibility was detected. At the adult plant stage resistant accessions without visible infections were identified for all diseases. The percentages of resistant accessions at that growth stage were always higher than the ones found in the material tested at the seedling stage. The probability for finding resistant material was shown to be highest in the diploid species ( > 50%) but decreased with increasing ploidy level to about 10% in the hexaploids. For Aegilops it was shown that most of the accessions were homogeneous and highly resistant against powdery mildew (seedling and adult plant stage), leaf rust (adult plant stage) and eyespot (seedling and adult plant stage/natural infection). The data obtained for the individual accessions are available via Internet (http://www.ipk-gatersleben.de). An erratum to this article is available at .     

中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记的克隆及序列分析

对获得的中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记OPW02-1756、OPO11-964、OPY13- 661、OPB11- 520、OPW05-766、OPV03-1365和OPJ16-759进行了回收、克隆、测序及序列分析。结果表明,7个RAPD标记的实际长度分别是1756bp、964bp、661bp、520bp、766bp、1365bp和759bp。OPW02-1756序列与3条欧洲葡萄cDNA克隆获得的EST序列有94 ~ 98%的同源性。OPO11- 964序列与欧洲葡萄“赤霞珠”的1条EST序列有93%同源性,与“霞多丽”的2条果实不同发育时期获得的EST序列有90%和87%的同源性,与甜橙在多种病原菌侵染后通过cDNA文库获得的1条EST序列有83%的同源性。OPO11-964最大的一个阅读框架包含444个碱基,编码147个氨基酸,该氨基酸序列和21个其它生物的未知功能蛋白序列有部分相似性。OPY13-661序列与欧洲葡萄16条EST序列有同源性,其中与“赤霞珠”cDNA克隆的EST有较高的同源性, 与“霞多丽”的2条叶片非生物胁迫有关的EST序列同源性均为89%。OPB11-520序列与拟南芥基因组4条未知功能DNA序列有94%同源性。OPW05-766序列与来自于酿酒葡萄的GAG-POL 前提有50%的同源性。OPV03-1365序列与水稻基因组6条序列有81 ~ 88%的同源性,与拟南芥基因组3条序列有84 ~ 91%的同源性。OPJ16-759与欧洲葡萄“霞多丽”叶片14条非生物胁迫EST序列有83 ~ 100%的同源性,与欧洲葡萄“Cabsau”浆果3条水分胁迫的EST序列有94 ~ 100%的同源性。     

Powdery mildew resistance of Nordic spring wheat cultivars grown in Estonia

Abstract

A group of spring wheat cultivars originating from Sweden, Finland, Norway, Germany, and the Netherlands was analysed for powdery mildew resistance. Using functional molecular markers, two alleles of the major resistance gene Pm3 were detected among the cultivars under the study. One of the alleles, Pm3d, was detected in the resistant cultivars ‘Vinjett’, ‘SW Estrad’, and ‘Zebra’, and in ‘Tjalve’, a cultivar of earlier release susceptible to the local population of powdery mildew. The second allele of Pm3 detected in the analysed group of cultivars was the allele Pm3f, rarely used in Europe. It was identified in the resistant cultivars ‘Satu’, ‘Helle’, and in the moderatively resistant cultivar ‘Mahti’. Pm3f was found to be effective against the local population of powdery mildew in Estonia, while Pm3d provided no protective effect. Besides the Pm3d allele on chromosome 1A, monosomic analysis of the cultivar ‘Vinjett’,which is almost immune to powdery mildew, identified two additional loci on chromosomes 5D and 7D, respectively, presumably responsible for the high resistance in this cultivar. In contrast to the earlier cultivars, six recently released cultivars (‘Vinjett’, ‘SW Estrad’, ‘Zebra’, ‘Satu’, ‘Helle’, ‘Meri’) demonstrated a high resistance to the powdery mildew fungus Blumeria graminis DC. f. sp. tritici both in the field and seedling tests, showing that the genetic basis of powdery mildew resistance in Nordic spring wheat has been improved noticeably in the last ten years.     

多抗小麦新品种扬辐麦5号的选育

为控制小麦黄花叶病及白粉病的危害,培育高产、多抗小麦新品种,以携带Pm4a抗白粉病基因高产小麦品种扬麦11为轮回亲本,以辐射诱变抗黄花叶病种质扬辐麦9311为供体亲本,通过回交转育方法,经辐射诱变和多年多点鉴定选择,育成高抗小麦黄花叶病、兼抗白粉病小麦新品种扬辐麦5号,2011年通过安徽省审定。该品种产量高,安徽省淮南麦区区域试验和生产试验较对照增产显著,小麦黄花叶病抗性达到高抗水平,抗白粉病,中抗纹枯病,品质指标达弱筋小麦标准,适合在长江中下游麦区种植。