山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like protein）与其互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）组成的CBL-CIPK系统，在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’（Vitis amurensis Rupr. ‘Shuangfeng’）叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库，库容量分别为1.7 × 106、1.3 × 106与1.9 × 106 cfu • mL-1，外源基因插入片段长度约为500 ~ 2 000 bp，重组率为100%，符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长（VaCIPK18）、激酶结构域缺失（VaCIPK18△S_TKc）以及NAF结构域缺失（VaCIPK18△NAF）为诱饵，进行酵母双杂交筛选，获得了17个候选互作靶蛋白；从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互作蛋白进行酵母回转验证，仅发现1个ABA信号通路上游信号调节因子VaPYL9与VaCIPK18有互作关系。通过酵母双杂交和双分子荧光互补验证，确定了VaPYL9可与VaCIPK18和VaCIPK18△NAF在酵母中物理互作，而在植物拟南芥原生质体中VaPYL9与VaCIPK18△S_TKc和VaCIPK18△NAF互作，但与全长VaCIPK18不互作。     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况，以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员，并进一步筛选其互作蛋白，为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础，获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况，应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证，并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因，随机分布于7条染色体上，都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域，均属于碱性不稳定亲水蛋白；聚类分析表明，葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族，其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近，VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明，VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

芥菜开花抑制因子SVP表达分析及其与FLC互作的调节位点鉴定

为阐明芥菜开花抑制因子SVP基因的表达特性及其与FLC蛋白互作的调节机制,从‘青叶芥’中克隆了SVP基因。定量PCR分析表明：低温春化途径和长日照光周期途径中SVP在叶片和茎尖均有表达。营养生长初期表达量较低（茎尖和叶片中平均相对表达量分别为0.56和0.35）,生殖生长早期则显著增加（春化途径的茎尖和叶片分别为0.60和1.27,光周期途径的茎尖和叶片分别为0.49和1.42）。茎尖中SVP对低温春化的反应比光周期敏感;而叶片中SVP对光周期的反应比低温敏感。酵母双杂交和 β–半乳糖苷酶活性测定显示：SVP蛋白I域突变体SVP^E90L以及K域突变体SVP^K104C和SVP^H106I均会削弱SVP/FLC₂蛋白的互作,但不会导致相互作用消失。SVP蛋白K域突变体SVP^R137L能完全破坏SVP/FLC₂的互作,但SVP^R137L仍然能与芥菜FLC₁、FLC₃、FLC₄和FLC₅相互作用,说明SVP/FLC₂的蛋白互作受到SVP第137位氨基酸的特异性调控。序列比对发现：芥菜FLC₄和FLC₅氨基酸序列完全相同,它们与FLC₃仅有1个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC_4-5之间分别有28、19、18个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC₄或FLC₅均不相同的位点有11个。推测FLC₂与FLC家族其他成员之间的变异位点很可能对SVP^R137L/FLC₂特异性调控有贡献。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性，在生物信息分析的基础上，以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料，利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示，葡萄LIM基因家族有14个成员，可分为4个亚族，各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大，但亚族内差异较小；分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现，二者存在钝化选择关系；多序列比对发现，该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域；保守基序分析结果表明，所有基因均包含motif2；基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子；14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明，高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现，VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调，且随处理时间的延长表达量显著增加。     

西北农林科技大学揭示植物维持锰稳态的重要机制

正西北农林科技大学王存课题组联合巩志忠课题组通过Aequorin报告基因以及Fluo-4染色方法,首次明确了高锰胁迫能够诱导产生Ca2+信号。基于此,进一步研究了钙信号在高锰胁迫中的作用和分子机制。通过系统筛选发现,钙依赖蛋白激酶CPKs家族中的CPK4/5/6/11与定位于液泡膜的锰转运体MTP8物理互作。利用多种蛋白互作技术证明了CPK4/5/6/11与MTP8互作的真实性。最后,通过体内体外磷酸化、酵母功能互补、     

月季RhNAC31互作蛋白的筛选及分析

为了进一步研究RhNAC31在胁迫响应中的作用机制，以RhNAC31蛋白为诱饵，利用酵母双杂交系统在切花月季‘萨曼莎’失水胁迫cDNA文库中进行了互作蛋白的筛选和分析。根据RhNAC31的转录激活区域（C端，157 ~ 286 aa）的序列特征，将其划分为C1（157 ~ 250 aa，RhNAC31-C1）和C2（251 ~ 286 aa，RhNAC31-C2）两段，分别构建到pGBKT7上检测其自激活活性及对酵母Y2H Gold细胞的毒性。结果显示，pGBKT7-RhNAC31-C1和pGBKT7-RhNAC31-C2对酵母Y2H Gold细胞均没有毒性，能激发金担子素A（Aureobasidin A，AbA）报告基因的表达，具有自激活活性，在含有400 ng ? mL-1 AbA的SD缺陷型培养基上其活性受到抑制，以含该浓度AbA的培养基作为筛选文库培养基。在此筛选条件下，在酵母双杂交文库中筛选到21个阳性克隆，对其测序并用Blast比对获得了16个与RhNAC31互作的候选蛋白。利用Uniprot网站对互作蛋白进行基因本体学分析，结果显示RhNAC31能够与RZFP34、MIEL1、RUB泛素连接酶E3、SGT1蛋白、DnaJ蛋白等多种蛋白相互作用，可能参与糖脂生物合成、蛋白质泛素化、植物防御、叶绿素生物合成、模式识别受体信号通路、蛋白质折叠、乙烯生物合成、胁迫响应等生物学过程。     

白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)BcMAX2调控腋芽生长的功能分析

MAX2(MORE AXILLARY GROWTH 2)是独脚金内酯信号转导相关基因，其功能与腋芽生长有关。以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）分蘖菜品种‘马耳头’和普通白菜品种‘苏州青’为材料，探究MAX2对腋芽生长的影响。结果表明：从两种材料中克隆得到的BcMAX2其开放阅读框序列没有差异，‘马耳头’的BcMAX2启动子序列有2个碱基的缺失。亚细胞定位分析表明BcMAX2定位在细胞核。在拟南芥中过表达BcMAX2抑制腋芽生长，BRC1表达量升高。在‘马耳头’中沉默BcMAX2能引起BcBRC1表达量降低并促进腋芽伸长。通过对白菜cDNA文库筛选得到197个与BcMAX2互作的候选蛋白，其中多数候选互作蛋白具有结合活性和催化活性，部分候选蛋白还参与植物的信号转导和逆境响应。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证最终得到2个与BcMAX2互作的蛋白。试验表明，白菜BcMAX2可能通过促进BcBRC1的表达来负调控腋芽的生长。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3，将其命名为CsCBF3，GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp，
编码204 个氨基酸。进化树分析表明，CsCBF3 隶属于CBF 基因家族，与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近，
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明，CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域，N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区，且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达，且
其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CsCBF3 是一个快速响应基因，推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1的筛选和鉴定

利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库,以月季乙烯受体蛋白RhETR3为诱饵,筛选能够与RhETR3结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到26个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个TspO/MBR蛋白家族的成员,命名为RhTSPO1。通过RACE分离了RhTSPO1基因全长,共777 bp,开放阅读框（ORF）为579 bp,编码192个氨基酸。在酵母中,利用酵母生长和β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了RhETR3和RhTSPO1之间确实存在互作。将RhETR3-GFP和RhTSPO1-mCherry融合蛋白共转入烟草,激光共聚焦显微镜观察发现RhTSPO1和RhETR3蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中,RhTSPO1在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势,与开放和衰老过程紧密联系,表明RhTSPO1可能参与了花朵开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。     

菠萝AcZFP1的克隆及其在低温胁迫下的功能分析

以‘神湾’菠萝为材料,克隆了1个C2H2型锌指蛋白基因,命名为AcZFP1,其开放阅读框为816bp,编码271个氨基酸,含有2个典型的锌指蛋白结构域。进化树分析表明AcZFP1与水稻Os ZFP252和OsMSR15的亲缘关系最近。基因表达分析发现,AcZFP1受低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）干旱等多种逆境胁迫及外源ABA、SA和MeJA的诱导。试验表明,AcZFP1蛋白定位于细胞核中。AcZFP1过表达的拟南芥株系在低温处理后相比野生型对照有更高的成活率和Fv/Fm值,可溶性蛋白含量增加,SOD、POD酶活增强,MDA含量降低,植株的耐寒性显著增强。进一步的qRT-PCR分析显示,AcZFP1可以促进AtRD29A、AtCOR47等4个典型的拟南芥内源冷应答基因的表达,在低温胁迫中发挥正调控作用。     

猕猴桃MYB家族成员鉴定及其低温表达分析

通过对‘红阳’猕猴桃基因组鉴定得到277个MYB家族成员并将其分为12个亚家族（S1～S12），其中多数序列属于R2R3-MYB，其次是MYB相关蛋白，仅鉴定到1个4R-MYB。S11和S12亚家族在进化上处于较早的位置，结构较为多样化，而S1和S2在进化上出现较晚。顺式作用元件分析显示，该家族主要含水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯等相关植物激素元件，还有部分参与昼夜节律、低温、细胞周期等相关元件。密码子偏好性分析显示，猕猴桃MYB家族有3个高频密码子（UUG、AGA和AGG），基因的密码子偏好使用A/T，第3位碱基偏好更强。通过顺式作用元件分析和4个猕猴桃品种越冬期转录组数据分析筛选了9个可能参与低温胁迫响应MYB基因，对其在低温胁迫下的软枣猕猴桃‘龙成2号’中进行检测验证，确认这些基因参与猕猴桃对低温的响应。     

番茄ERFb.2转录因子的克隆、生物信息学及表达特征分析

通过克隆番茄SlERFb.2基因,并运用生物信息学对该基因的编码产物进行一级、二级、三级结构分析,并通过qRT-PCR技术检测SlERFb.2基因在不同处理不同时期的表达量,以期为番茄对非生物胁迫的响应机制提供参考依据.结果 表明:SlERFb.2基因含有开放阅读框5个,共编码258个氨基酸,属于酸性蛋白;其二级结构以α-螺旋为主,预测蛋白定位于细胞核上;且含有39个磷酸化位点与15个糖基化位点;启动子区主要以I-box为主,且含有多个诱导基因表达的顺势作用元件;三级结构相对简单,且该转录因子在番茄中存在4个互作蛋白,系统发育树得番茄与马铃薯的亲缘关系最近;qRT-PCR显示该基因对低温的响应特别敏感.     

草莓LIM家族候选基因的鉴定及在非生物胁迫下的表达

利用NCBI、GDR数据库对草莓LIM家族候选基因在草莓基因组水平进行生物信息学分析,鉴定获得4个亚族37个候选LIM基因,其中9个来自森林草莓(Fragaria vesca L.),28个来自凤梨草莓(F. ananassa Duch.)。草莓LIM家族候选基因主要分布在细胞核;其密码子偏好性较弱,偏向使用以A/T结尾的同义密码子。FvLIM和FaLIM启动子序列上游2 kb区域包含大量激素及非生物胁迫响应元件。10%PEG、200 mmol·L-1 NaCl、4℃低温胁迫下,随着处理时间延长LIM家族候选基因在凤梨草莓‘红颜’中比森林草莓中上调趋势更明显。4℃低温处理下,森林草莓中以FvLIM5(12 h)和FvLIM7(24 h)上调最为明显,而凤梨草莓‘红颜’中以FaLIM25(12 h)和FaLIM18(24 h)上调最为显著,总体对低温响应较明显。实时荧光定量PCR分析结果表明,草莓LIM家族候选基因在不同组织中的表达量存在一定差异,在根和花中的表达量偏高。综合以上分析结果,预测草莓LIM家族候选基因可能在响应非生物胁迫以及根和花的发育中发挥重要作用。     

苹果MLP家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

在苹果中鉴定了13个Major Latex Protein(MLP)家族基因Md MLP。序列比对及构建蛋白同源模型发现,Md MLP蛋白含有Bet_v1典型的Gly-rich loop区域结构,且为MLP家族特有的Gxxxxx G结构。经多物种MLP系统发育及共线性比较分析,Md MLP与其他蔷薇科物种MLP具有相似基因结构和蛋白质保守结构域。q RT-PCR分析表明,Md MLP在‘新疆1号’苹果14个器官组织中均有不同程度的表达,对ABA、Na Cl、PEG、低温(4℃)和高温(40℃)有一定响应,且同一亚族基因表达情况呈现相似趋势。String构建蛋白互作网络发现,Md MLP可能通过与PRSP、SNRK1/2、b HLH等应激、ABA相关转录蛋白互作,参与苹果对非生物胁迫的防御。     

多毛番茄CIPK基因家族生物信息学分析及低温下功能研究

CIPK基因家族是Ca~(2+)介导的植物信号转导途径中的一个关键家族,在植物胁迫响应和生长中起着关键作用。本试验基于多毛番茄全基因组数据筛选出24个多毛番茄CIPK基因家族成员,系统进化分析将家族成员分为5个亚组,家族成员内部含有5个基因复制对。亚细胞定位分析表明,多毛番茄CIPK基因大多定位于细胞质;少数分布于质膜、细胞核、线粒体。共线性分析结果表明,拟南芥和栽培番茄中的CIPK基因家族中分别有14个和12个基因与多毛番茄存在共线性关系。顺式作用元件分析结果表明,多毛番茄CIPK基因家族基因含有光、激素、冷胁迫等相关的元件。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫下ShCIPK2、ShCIPK17、ShCIPK19表达量显著提高,推测这3个基因可能在多毛番茄低温胁迫应答中起重要的作用。     

苹果NCL家族基因与根系细胞钙离子浓度变化的关系

基于拟南芥类Na⁺/Ca²⁺交换蛋白(NCX-Like,NCL)序列以及苹果、葡萄、草莓、桃和梨全基因组信息，分析了NCL家族特征、苹果MdNCL表达以及不同处理下湖北海棠根系MhNCL的表达水平与细胞Ca²⁺浓度变化的关系。结果表明，NCL家族成员在进化中高度保守，苹果基因组中的4个MdNCL的启动子上均含有胁迫响应及激素应答相关的顺式作用元件，且在苹果各器官均有不同程度表达。依据MdNCL保守结构域，从湖北海棠中确定4个相应的MhNCL基因(MhNCL-1、MhNCL-2、MhNCL-3和MhNCL-4)，其中MhNCL-1、MhNCL-3和MhNCL-4的表达水平在NaCl和CaCl₂处理下基本呈现“变化不大—上升—下降”的规律，在ABA和IAA处理下表现出“变化不大—上升—下降—上升”的特征。根系细胞Ca²⁺浓度在NaCl和CaCl₂处理下呈现“升高—降低—小幅度升高”的规律，在ABA和IAA处理下呈现“升高—降低—升高—降低”的趋势，初步表明根系...     

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能，采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员，分析其低温胁迫下的表达情况，为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A（Musa acuminata）基因组筛选了22条漆酶基因（MaLAC），从香蕉B（Musa balbisiana）基因组筛选了11条漆酶基因（MbLAC），通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类，MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明，MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件，推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析，MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温（13、4、0 ℃）处理下表达量均极显著高于对照（28 ℃），推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控，主要受miR397和miR408的调控；推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。     

白菜翻译起始因子eIF(iso)4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

为阐明白菜翻译起始因子异构体eIF(iso)4E的表达特性,以及该异构体与芜菁花叶病毒(TuMV)的互作关系,在白菜‘极早春’中克隆了eIF(iso)4E.a基因,在‘BP8407’中克隆了eIF(iso)4E.c基因。这两个基因长度一致,均编码200个氨基酸。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明:eIF(iso)4E.a仅与TuMV-C4株系互作,而不与TuMV-UK1株系互作;eIF(iso)4E.c仅与TuMV-UK1株系互作,而不与TuMV-C4株系互作。对白菜eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列及空间结构分析发现:eIF(iso)4E蛋白包含帽结合蛋白结构,eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c蛋白间存在20个差异氨基酸,其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上;TuMV-C4 VPg与TuMV-UK1 VPg蛋白有4个氨基酸差异位点。通过对TuMV不同株系的VPg蛋白(病毒基因组连接蛋白)氨基酸序列频率分析发现,在4个氨基酸差异位点处,氨基酸的使用频率具有选择性。     

低温胁迫下北海道黄杨叶肉细胞Ca2+和Ca2+-ATPase的变化

 利用焦锑酸钙沉淀和硝酸铅沉淀的电镜细胞化学方法,以室温生长的北海道黄杨植株为对照,研究了人工4 ℃低温胁迫过程中北海道黄杨（Euonymus japonicus‘Cuzhi’）叶肉细胞Ca²⁺和Ca²⁺-ATPase的动态变化。在4 ℃低温胁迫的初期（3 ~ 12 h）,北海道黄杨叶肉细胞间隙和液泡内的Ca²⁺沉淀颗粒减少,而细胞质和细胞核内的Ca²⁺水平升高,但Ca²⁺-ATPase在细胞的分布几乎没有变化,主要分布在质膜和液泡膜上,有较高的活性;低温胁迫24 h,细胞质和细胞核内增加的Ca²⁺开始回到细胞间隙和液泡中,Ca²⁺-ATPase在质膜和液泡膜上活性增强;在低温胁迫48 ~ 96 h,细胞内的Ca²⁺又回到低温胁迫前的低水平,但Ca²⁺-ATPase在质膜和液泡膜上仍有很高的活性。叶肉细胞内Ca²⁺稳态平衡和Ca²⁺-ATPase的活性变化与植物的抗寒性存在一定的相关性。     

亚适温、弱光照及盐胁迫下辣椒叶片活性氧代谢特征

 测定了亚适温(18 ℃/10 ℃, 昼/夜) 、弱光(80μmol·m- 2 ·s- 1 ) 及盐胁迫(70 mmol· L ^-1 NaCl) 逆境下辣椒叶片抗氧化酶活性及活性氧、丙二醛(MDA) 含量等指标。整个试验期间(处理后1～15 d) , 亚适温、弱光与盐胁迫对SOD、CAT、GR活性均存在显著或极显著的互作效应, 试验前期(处理后1～9 d) 对APX、GPX活性及O₂^- 、H₂O₂含量存在显著或极显著的互作效应, 试验后期(处理后5～15 d) 对MDA含量存在显著或极显著的互作效应。亚适温主效应对辣椒叶片SOD、GPX、GR活性及O₂^- 、H₂O₂、MDA含量的影响大于弱光、盐胁迫主效应, 对APX、CAT活性影响较大的是盐胁迫主效应。