果树分子标记辅助育种研究进展

随着分子生物学的不断发展,分子标记在果树育种中发挥的作用也愈发重要。本文主要对不同果树育种的分子标记类型及分子标记在果树种质资源鉴定、抗性育种、无核育种、早熟育种、品质改良育种、分子遗传图谱构建与数量性状座位(QTL)基因定位等方面的应用进行了综述,为果树分子标记辅助育种提供参考。     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况，以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员，并进一步筛选其互作蛋白，为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础，获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况，应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证，并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因，随机分布于7条染色体上，都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域，均属于碱性不稳定亲水蛋白；聚类分析表明，葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族，其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近，VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明，VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like protein）与其互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）组成的CBL-CIPK系统，在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’（Vitis amurensis Rupr. ‘Shuangfeng’）叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库，库容量分别为1.7 × 106、1.3 × 106与1.9 × 106 cfu • mL-1，外源基因插入片段长度约为500 ~ 2 000 bp，重组率为100%，符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长（VaCIPK18）、激酶结构域缺失（VaCIPK18△S_TKc）以及NAF结构域缺失（VaCIPK18△NAF）为诱饵，进行酵母双杂交筛选，获得了17个候选互作靶蛋白；从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互作蛋白进行酵母回转验证，仅发现1个ABA信号通路上游信号调节因子VaPYL9与VaCIPK18有互作关系。通过酵母双杂交和双分子荧光互补验证，确定了VaPYL9可与VaCIPK18和VaCIPK18△NAF在酵母中物理互作，而在植物拟南芥原生质体中VaPYL9与VaCIPK18△S_TKc和VaCIPK18△NAF互作，但与全长VaCIPK18不互作。     

葡萄VvJAZ9蛋白原核表达与多克隆抗体制备

JAZ蛋白是茉莉酸(JA)信号调控途径中的重要组分，也是调节JA参与植物生长发育以及逆境应答的关键因子。JAZ9基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为研究欧洲葡萄VvJAZ9蛋白参与低温胁迫的功能，本试验以欧洲葡萄霞多丽叶片为研究材料，通过同源克隆获得了VvJAZ9基因序列，其全长807 bp，编码268个氨基酸，定位于第11条染色体，有5个外显子和4个内含子；VvJAZ9蛋白具有JAZs家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和CCT＿2结构域，与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明，VvJAZ9基因在低温处理1～24 h后表达量呈上升趋势，在24 h表达量最高。亚细胞定位结果证实VvJAZ9定位于细胞核。将VvJAZ9的开放阅读框(ORF)序列克隆至原核表达载体pET28b上，在大肠杆菌(E. coli BL21)中经37℃、1.0 mmol·L^-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvJAZ9-His融合蛋白，再经抗原免疫，血清纯化后制备anti-VvJAZ9兔源多克隆抗体。蛋白...     

不同激素处理下番茄实时荧光定量聚合酶链反应内参基因的筛选

为筛选出在不同激素诱导下番茄中较为稳定的内参基因，本研究以脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)3种外源激素分别诱导处理0、24、48、120 h的感病番茄品种‘Moneymaker’(MM)和抗病番茄自交系62579叶片为试验材料，通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行扩增，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件分析EF1α、L33、Act、Ubi、GAPDH、UK、CAC、TIP41这8个番茄候选内参基因的表达稳定性。结果表明，8个候选内参基因的平均C_T值为26～34。综合3个软件的分析结果发现，在ABA诱导下，番茄中较稳定表达的内参基因为L33和Ubi；在MeJA诱导下，番茄中较稳定表达的内参基因为L33和EF1α；在SA诱导下，番茄中较稳定表达的内参基因为EF1α和L33。综上所述，L...