亚硝基谷胱甘肽还原酶 GSNOR1正调控植物对疫霉菌的抗性

疫霉属（ Phytophthora）卵菌引致马铃薯晚疫病等作物灾难性病害，严重威胁作物的可持续生产。由于病菌毒性变异，导致品种抗病性丧失问题突出。因此，挖掘植物广谱和持久抗病基因，并探索其在抗病育种中的有效利用具有重要的科学意义。亚硝基谷胱甘肽还原酶1（GSNOR1）是植物氮信号通路中高度保守的关键还原酶，其参与调节r基因介导的植物抗性和非寄主抗性。然而， GSNOR1参与抗疫霉菌的免疫功能和作用机理尚不清楚。本研究中，借助拟南芥与寄生疫霉菌互作的模式体系，首先发现拟南芥T-DNA插入突变体 gsnor1-3对寄生疫霉菌呈现感病表型。进一步利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）降低烟草叶片中 GSNOR1同源基因的表达量，在此基础上，通过抗病表型分析以及一系列抗性相关功能的检测，结果表明，沉默本氏烟草 GSNOR1同源基因能够在寄生疫霉菌侵染植物的过程中削弱植物体内的活性氧（ROS）迸发、病程相关基因（PR genes）的诱导表达以及MAPK信号转导，从而增强了植物对疫霉菌的感病性。本研究揭示了植物 GSNOR1对疫霉菌具有高度保守的抗性功能，并初步解析了 GSNOR1正调控植物抗疫霉菌的作用机理，为进一步探索 GSNOR1在马铃薯抗晚疫病中的功能及其在抗病育种中的有效利用奠定了重要的理论 基础。     

基于Gateway技术的植物表达载体的构建

【目的】为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体。【方法】分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连入根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试。【结果】成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达。【结论】基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆。     

棉铃疫病潜伏侵染的研究

分离试验确证,存在于抗病阶段棉铃上限制性褐色坏死病组织中,疫病菌并不完全失活,说明该病菌存在潜伏侵染.州铃的抗病性表现在抗扩展上.棉铃的抗病性与其发育阶段和环境条件密切相关.花后35天以上的棉铃感病,而花后25天以前的幼铃高度抗病.初步认为,疫病菌侵染后诱导发生的病变特别是酮溶性植物抗毒素的累积,是病菌潜伏侵染及棉铃阶段抗病性的重要机制.高湿等极端环境能诱发抗病阶段的幼铃高度感病.     

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究

通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持。利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb 1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件。研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3~0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液OD600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高。测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6~8周的烟草适合分析。通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件。     

棉铃疫病病菌侵染行为观察

本研究观察了棉铃疫病病菌（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｂｏｅｈｍｅｒｉａｅ）的侵染前行为及其侵染过程，表明温度和淋溶物影响孢子囊的萌发方式，１８～２０℃条件下全行间接萌发，２２～２４℃条件下表现孢子囊直接萌发量增多，并迅速产生次级孢子囊。人工游动孢子接种证明该病菌主要为害棉铃，此外还能有效地侵染棉苗及成株叶片。在铃表在附着胞形成较棉叶上迅速，且有次级乃至三级附着胞产生。棉铃气孔是病菌入侵的主要途径；在叶表该病菌气孔保卫细胞与表皮细胞毗邻的垂周壁侵染。接种体浓度愈高，游动孢子侵染棉叶的潜育期愈短，２４小时即能检出新生孢子囊，孢囊梗由气孔伸出；与此同时，在病组织中有性器官也开始形成。在棉病铃壳、内果皮、铃纤维以及种皮中均见有卵孢子。田间遗留的棉花枝叶有富集菌源作用。     

榆林地区马铃薯疮痂病的田间药剂防治

针对榆林地区马铃薯产区疮痂病高发且逐年加重的趋势，通过5种杀菌剂组合处理（70%甲基托布津WP播种期拌种+杀菌剂生长期灌根），以及2种微生物菌肥组合处理（播种期拌种或生长期灌根），探究不同处理对疮痂病的防治效果。结果表明：各处理对疮痂病均有不同程度的防治效果，其中芽孢杆菌复合生物菌剂灌根处理和70%甲基托布津WP拌种+47%春雷王铜灌根处理对疮痂病防治效果最好，防效分别为  67.84%和56.09%；商品薯率及产量均显著高于不施药对照，商品薯率分别增加26.88%和25.80%，产量分别增加62.39%和45.77%。综上可知，芽孢杆菌复合生物菌剂灌根处理和70%甲基托布津WP拌种+47%春雷王铜灌根处理在防治疮痂病及提高马铃薯产量等方面表现良好，具有一定的应用潜力。     

种薯处理对防控马铃薯烂薯病的效果

针对榆林马铃薯产区常年发生的田间烂薯问题,通过防控试验,比较药剂种薯处理和茎叶喷施对控制马铃薯烂薯病害的效果,初步分析导致马铃薯烂薯病害的病原菌种类及初侵染源,为大田防控提供依据。研究结果表明,50%烯酰吗啉种薯处理和茎叶喷施防控的田块,马铃薯产量、薯块商品率及总产值均显著高于农户未防治田块;种薯处理结合茎叶喷雾防控的田块,其马铃薯产量比单纯茎叶喷雾防控田块提高15.7%,纯收入增加27.6%。从田间病薯中未分离出晚疫病菌,表明当地烂薯的发生不是由晚疫病菌引起的。种薯药剂处理作为马铃薯安全生产的一个重要环节,对控制田间烂薯效果明显,可以作为马铃薯病害综合防控技术的关键环节,在陕西榆林马铃薯生产中推广应用。     

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害。为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体。将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中,检测到诱饵载体无自激活作用。利用酵母双杂交技术以AL为诱饵筛选晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA文库,初步获得6个候选AL寄主靶标。对6个候选靶标与AL进行一对一互作验证,结果表明其中有5个与诱饵载体强互作,1个弱互作。这些候选寄主靶标包括热休克蛋白同源蛋白、单脱氢抗坏血酸还原酶蛋白、过氧化物酶体蛋白等。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

分子伴侣4-苯基丁酸通过抑制内质网应激减轻寄生疫霉菌对植物的侵染

旨在利用内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）探究内质网应激对疫霉菌侵染寄主植物的影响机制。以拟南芥与寄生疫霉菌的亲和互作为研究体系,分析野生型Col-0植株响应寄生疫霉菌侵染的鲜质量及生长表型变化以及4-PBA对其影响;利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析4-PBA对内质网应激标记基因 BiP3的诱导表达以及寄生疫霉菌侵染植物的影响;通过4-PBA处理拟南芥幼苗和活体植株,分析其对植物生长表型的影响。结果表明,分子伴侣4-PBA作为内质网应激修复剂,在不影响植物正常生长的同时,不仅能够减轻寄生疫霉菌侵染引发的植物生长受阻和 BiP3基因的诱导表达等内质网应激标志性事件,还对寄生疫霉菌在植物体内的扩展和定殖具有抑制作用,从而减轻植物的感病性。研究结果有助于揭示内质网应激对植物与微生物互作的影响机制,也为开发新型药物靶点用于作物疫霉属卵菌病害的绿色综合防控提供了新思路。