马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

分子伴侣4-苯基丁酸通过抑制内质网应激减轻寄生疫霉菌对植物的侵染

旨在利用内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）探究内质网应激对疫霉菌侵染寄主植物的影响机制。以拟南芥与寄生疫霉菌的亲和互作为研究体系,分析野生型Col-0植株响应寄生疫霉菌侵染的鲜质量及生长表型变化以及4-PBA对其影响;利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析4-PBA对内质网应激标记基因 BiP3的诱导表达以及寄生疫霉菌侵染植物的影响;通过4-PBA处理拟南芥幼苗和活体植株,分析其对植物生长表型的影响。结果表明,分子伴侣4-PBA作为内质网应激修复剂,在不影响植物正常生长的同时,不仅能够减轻寄生疫霉菌侵染引发的植物生长受阻和 BiP3基因的诱导表达等内质网应激标志性事件,还对寄生疫霉菌在植物体内的扩展和定殖具有抑制作用,从而减轻植物的感病性。研究结果有助于揭示内质网应激对植物与微生物互作的影响机制,也为开发新型药物靶点用于作物疫霉属卵菌病害的绿色综合防控提供了新思路。     

利用田间抗病基因近等混合系防治马铃薯晚疫病

马铃薯是世界上第四大粮食作物,是我国七大农作物之一。晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的毁灭性的病害,19世纪中叶曾造成举世闻名的“爱尔兰大饥荒”,至今仍然是马铃薯最严重的病害。提高抗晚疫病的水平是马铃薯育种的重要目标。马铃薯抗晚疫病育种是通过遗传操作来抵抗植物病害的最早的人类实践之一,但至今收效甚微,从野生种导入的抗病基因在田间很容易失效。马铃薯和致病疫霉菌的互作关系符合经典的“基因对基因”假说,只有马铃薯的抗病基因和致病疫霉菌的非毒力基因同时存在并表达时,抗病反应才能发生。致病疫霉菌是一种进化潜力非常高的病原,可以快速突变本身的非毒力基因,因而造成对应的马铃薯抗病基因的失效。要提高抗病基因的持久性,目前唯一的途径是同时释放多个抗病基因,人为造成田间抗病基因的多态性。马铃薯抗晚疫病基因的克隆取得了快速的发展,为通过转基因的手段创造田间抗晚疫病基因的多态性提供了基础。     

RNA病毒诱导的烟草WRKY转录因子基因的应急表达

植物和病毒在基因水平上的互作是植物感病和抗病的分子基础。以模式植物烟草及其3种RNA病毒（马铃薯Y型病毒,Potato virus Y,PVY;烟草花叶病毒,Tobacco mosaic virus,TMV;黄瓜花叶病,Cucumber mosaic virus,CMV）为试材,旨在研究受病毒共同诱导、并可能在植物抗病反应中具有重要功能的转录因子基因。试验首先获得10个受病毒诱导的烟草同源基因。在比较了3种病毒侵染、低温和盐害协迫以及逆境信号物质(茉莉酸甲酯与水杨酸)处理对上述基因表达的影响后发现, 3种RNA病毒所诱导的植物基因有所不同。但属于WRKY基因家族的06G基因受3种病毒的共同、高效诱导,其表达水平与叶片发育程度呈负相关。研究结果表明, 该基因在植物病毒病发生及植物抗病分子育种中可能有重要意义。     

过表达玉米ZmSC1基因增强转基因拟南芥的耐盐性

旨在从玉米中克隆耐盐相关基因ZmSC1,分析其分子特征并在拟南芥中研究其耐盐性的生物学功能。以玉米B73为试验材料,克隆ZmSC1全长序列,与其他物种进行同源性比对,解析其盐诱导表达模式和亚细胞定位情况,将ZmSC1转入到拟南芥突变体atsc和野生型中,观察在盐处理下种子萌发率和主根根长情况,利用荧光定量PCR分析相关逆境（140 mmol·L^-1胁迫）基因的表达量。结果表明,ZmSC1基因全长为423 bp,编码141个氨基酸,ZmSC1和小麦、拟南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有较高保守性。烟草细胞瞬时表达、玉米原生质体亚细胞定位研究表明ZmSC1定位于细胞膜中。生物学功能研究发现在140 mmol·L^-1的NaCl的盐处理下,相比较于拟南芥突变体,回补植株拟南芥的种子萌发率和主根根长得到了明显改善,这说明ZmSC1基因可以回补拟南芥同源基因AtSC1突变体植株在盐胁迫下的表型。ZmSC1基因过表达拟南芥植株的种子萌发率和主根根长也显著高于野生型植株。荧光定量PCR结果显示相较于野生型,在过表达植株中AtRD29A、AtSOS2、AtSOS3、AtCDPK1等胁迫相关基因的表达量也明显增强。研究结果表明TaSC1、AtSC1的同源基因ZmSC1对提高拟南芥的耐盐性具有重要作用。     

转录因子TaMADS2在小麦-叶锈菌互作中的功能研究

为探究转录因子TaMADS2在小麦抗叶锈病中的功能，以TaMADS2基因在亲和/非亲和小麦与叶锈菌互作过程中上调表达，且在非亲和组合中上调表达时期较亲和组合更早为依据，利用BSMV-VIGS技术沉默‘中国春’‘郑麦9023’中TaMADS2基因表达，观察TaMADS2沉默植株的表型以及病程相关基因的转录水平变化。结果表明:在接种叶锈菌后，TaMADS2基因沉默植株较对照相比叶锈菌感染加重，单侵染点处活性氧积累面积减小，菌丝长度增加，发病面积增大，促进了病原菌的生长，减弱了植物的抗性反应；通过qRT-PCR分析发现在叶锈菌侵染早期，病程相关基因TaPR1和TaPR2的表达水平下调。综上，TaMADS2基因可能通过调控抗病相关基因的表达正向调控小麦对叶锈菌的抗性。     

华南地区推广应用大豆品种对疫霉根腐病的抗性评价

【目的】评价华南地区大豆 Glycine max (L.)Merrill品种（系）及其亲本对7个大豆疫霉菌 Phytophthora sojae 的抗性.【方法】采用下胚轴创伤接种法鉴定67个品种（系）及其亲本对7个不同毒力的大豆疫霉菌菌株的抗性.【结果和结论】67个品种对7个不同毒力菌株PGD1、Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率不同,接种大豆疫霉菌PGD1的侵染率最高,PGD1是华南地区发现并分离的大豆疫霉菌新种,抗PGD1的品种有华夏6号、粤夏2011-4、桂春6号、桂春10号、桂夏1号、浙春3号,占鉴定品种的9%;其次是Pm28和Pm14,接种PNJ1和PNJ4的侵染率较低;另外,对7个大豆疫霉菌菌株都表现感病的品种有29个,占鉴定品种的43.3%.华南地区抗或多抗大豆疫霉根腐病的大豆品种较少,需要加强大豆品种抗病种质资源筛选和抗病育种研究.     

植物凝集素MNB1基因启动子表达载体的构建及鉴定分析

近年来植物受逆境胁迫的影响日益严峻，而逆境胁迫是造成现代农作物减产的重要因素之一。MNB1基因是拟南芥中与甘露糖高度特异性结合的植物凝集素，具有多种生物学功能，对植物的生长发育及逆境胁迫的应答有着至关重要的调控作用。以拟南芥为试验材料，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术成功构建了ProMNB1:GUS植物表达载体，结合浸花法，成功将ProMNB1:GUS载体转化到拟南芥中，最终通过PCR鉴定分析获得ProMNB1:GUS阳性植株，为研究逆境胁迫下MNB1基因的功能及其转录水平的变化提供了重要的依据。     

辣椒转录因子CaNAC083对高温胁迫的响应

【目的】分析辣椒NAC转录因子CaNAC083在高温胁迫响应中的作用,为阐明辣椒耐高温机理奠定基础。【方法】以辣椒P70为材料,扩增CaNAC083基因,对其进行生物信息学分析,在辣椒中构建基因沉默载体沉默该基因,用RT-qPCR检测沉默效率以及高温胁迫相关基因CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90的相对表达量,测定42 ℃高温胁迫处理10 h前后丙二醛（MDA）含量、相对电导率、F_v/F_m、活性氧（H₂O₂和O^-₂·）含量以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性的变化,观测二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色情况;同时构建过量表达载体转化拟南芥,测定42 ℃高温处理12 h前后的MDA含量、活性氧含量、相对电导率以及抗氧化酶活性的变化,探讨CaNAC083基因对植株耐高温能力的影响。【结果】CaNAC083属于NAP亚家族的一员,且与典型的NAP亚家族成员的结构一致。CaNAC083基因沉默辣椒植株在高温胁迫后叶片损伤较轻,MDA、相对电导率以及活性氧均低于对照植株,而POD、SOD和CAT活性高于对照植株,CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90相对表达量均高于对照植株。过表达CaNAC083拟南芥株系在高温胁迫下受害程度较WT严重,MDA、相对电导率以及活性氧含量均高于WT,而POD、SOD和CAT活性均低于WT。【结论】CaNAC083基因沉默可以增强辣椒植株的耐高温性,过表达该基因则减弱植株的耐高温性,判断CaNAC083在植物高温胁迫中可能起负调控作用。     

唐菖蒲蛋白磷酸酶GhPP2C1基因功能及其对ABA的响应

为探究唐菖蒲GhPP2C1（Protein phosphatase 2C1）的功能及对脱落酸（Abscisic acid,ABA）的响应,以唐菖蒲‘Rose Supreme’为试材,利用同源克隆的方法获得ABA信号转导过程中的关键蛋白磷酸酶基因GhPP2C1,利用实时荧光定量分析、亚细胞定位和启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色等方法检测其对ABA的响应情况;对其启动子序列进行响应元件分析;在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因,对转基因株系进行ABA敏感性测定、株型分析及下游基因表达情况分析。结果表明：1）GhPP2C1的表达在ABA处理的诱导下显著上调。2）GhPP2C1定位于细胞质中,可被ABA处理诱导入核。3）GhPP2C1基因启动子包含ABA、赤霉素（Gibberellins,GAs）、干旱和低温相关响应元件。在烟草叶片和拟南芥根尖中,GhPP2C1启动子活性可被ABA激活。4）在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因导致ABA信号通路中下游基因的表达量显著下降并出现分枝数、株高和种荚数量明显增加的表型。综上,推测唐菖蒲GhPP2C1可能通过减弱ABA信号传导,促进种子休眠解除,且在植株营养生长过程中也发挥作用。     

Vacuolar processing enzyme positively modulates plant resistance and cell death in response to Phytophthora parasitica infection

Oomycete, particularly Phytophthora species, causes the most devastating crop diseases, such as potato late blight, and threatens the sustainable crop production worldwide. Our previous studies identified Resistance to Phytophthora parasitica 1 (RTP1) as a negative regulator of Arabidopsis resistance to multiple biotrophic pathogens and RTP1 loss-of-function plants displayed rapid cell death and reactive oxygen species (ROS) production during early colonization of P. parasitica. In this study, we aim to decipher the mechanism of RTP1-mediated cell death, and identify a member of vaculoar processing enzymes (VPEs), γVPE, playing a role in rtp1-mediated resistance to P. parasitica and cell death occurrence. Our results showed up-regulation of the expression of γVPE as well as increased VPE/caspase 1-like protease activity in P. parasitica-infected rtp1 mutant plants. Besides, we found that the VPE/caspase 1-like protease activity was required for the cell death occurrence in Arabidopsis plants during the infection of P. parasitica as well as rtp1-mediated resistance to P. parasitica. Further pathogenicity assays on either Arabidopsis γvpe mutant plants or leaves of Nicotiana benthamiana with transient overexpression of γVPE demonstrated γVPE could positively affect plant resistance to P. parasitica. Together, our studies suggest that γVPE might function as an important regulator of plant defense and cell death occurrence in response to P. parasitica infection, and VPE/caspase 1-like protease activity is required for rtp1-mediated resistance to P. parasitica.     

芽孢杆菌拮抗镰孢菌机制的研究进展

镰孢菌（Fusarium）分泌多种真菌毒素引起的枯萎病、赤霉病、根腐病和穗腐病等植物病害,造成重大的作物生产损失。化学防治是防治镰孢菌的重要手段,但其带来的镰孢菌抗性和生态环境污染等问题,严重制约了农业可持续发展。在病害管理中使用生物防治剂为控制镰孢菌引起的植物病害提供了一种安全、有效和可持续的手段,因此生物防治具有比化学防治更深远的优势。在生物防治剂中使用最广泛的生防微生物是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员,其可通过多种机制为植物提供有效控制镰孢菌入侵的方案。芽孢杆菌作为一种优良的生物防治剂已被广泛研究,其可通过生态位竞争、产生抗菌物质、诱导植物系统抗性和塑造根际健康微生物组来拮抗镰孢菌侵染,本文从以上4个方面对芽孢杆菌拮抗镰孢菌的机制进行综述,为农业生产中芽孢杆菌防治镰孢菌病害的研究提供参考。     

PnSCR82, a small cysteine-rich secretory protein of Phytophthora nicotianae,can enhance defense responses in plants

A number of plant pathogenic species of Phytophthora are known to produce different classes of secretory proteins during interactions with their hosts. Although several small cysteine-rich (SCR) secretory proteins, conserved in oomycete pathogens, have been identified in Phytophthora, their specific involvement in these interactions remains unknown. In this study, an SCR effector encoded by PnSCR82 in P. nicotianae was identified and shown to have similarities to P. cactorum phytotoxic protein, PcF (Phytophthora cactorum Fragaria). Agroinfection with potato virus X vector, PnSCR82, was capable of inducing plant hypersensitive cell death in Nicotiana benthamiana and Solanum lycopersicum. Real-time PCR results indicated that transiently expressed PnSCR82 in N. benthamiana leaves activated the jasmonate, salicylic acid and ethylene signaling pathways. Transient expression of PnSCR82 enhanced plant resisitance to P. capsici. In summary, our results demonstrated that P. nicotianae PnSCR82 elicits defensive responses in N. benthamiana and may potentially play a significant role in future crop protection programs.     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

丁香假单胞菌的分子生物学研究进展

丁香假单胞菌是好氧、腐生性强的革兰氏阴性菌,所引起的植物病害发生率位居十大细菌性植物病害之首,尤其引发的疫病在各农业大国爆发并有在世界范围扩散的趋势,给各国农业生产造成巨大的经济损失。基于国内外学者最新的分子生物学研究报道,对丁香假单胞菌的致病变种、病原菌鉴定、植物检疫、早期快速检测技术、致病机制及生物防治等方面进行综述,并探讨现阶段该病害研究存在的问题以及未来的研究方向与防治方案。     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

蜻蜓凤梨AfACO1基因的克隆及乙烯响应特性分析

观赏凤梨是一种重要的热带花卉。生产上常人工施加外源乙烯或乙烯衍生物促进凤梨科植物开花,但作用的分子机制不清楚。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料,利用转录组数据结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了乙烯生物合成过程中限速酶1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1carboxylate,ACC)氧化酶(ACC oxidase,ACO)的一个编码基因,将其命名为AfACO1。AfACO1cDNA全长732bp,编码156个氨基酸。理化性质分析表明,该蛋白分子质量为17.47ku,等电点为8.46。AfACO1蛋白有保守的抗坏血酸和辅因子亚铁离子结合位点。进化树分析结果表明,AfACO1与水稻的2个OsACO1-likes蛋白亲缘关系最近,且进一步的结构域分析表明,它们拥有相似的保守基序。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)结果表明,AfACO1在抽薹39d后的成株心叶中表达量最高,且施加外源乙烯利后,AfACO1的表达量逐渐上调。结果表明AfACO1可能是蜻蜓凤梨成熟期乙烯生物合成的关键酶之一。研究结果为解析外源乙烯调控凤梨科植物开花的机制奠定了基础。     

小桐子CDPK及相关激酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

基于小桐子基因组数据库,在全基因组水平对小桐子CDPK及相关激酶基因家族进行鉴定,并对其系统进化、基因结构、保守结构域、染色体定位以及器官与低温胁迫表达进行分析,为深入开展小桐子CDPK及相关激酶基因的功能鉴定及其在小桐子遗传改良中的应用提供依据。利用CDPK结构域的隐马尔可夫模型对小桐子蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得小桐子CDPK及相关激酶基因家族成员。利用不同的工具对CDPK及相关激酶基因进行生物信息学对比分析。通过小桐子器官与低温表达谱数据进行CDPK及相关激酶基因的表达分析。小桐子基因组中共检索到17个CDPK基因、5个CRK基因、2个PPCK基因、4个PEPRK基因以及1个CCaMK基因,各基因家族成员的基因长度、蛋白质等电点及亚细胞定位等理化参数具有家族特异性。序列比对与系统进化分析显示,5个基因家族都单独聚类,而CDPK与PEPRK基因家族又分别聚类为4个与2个亚族,且鉴定到小桐子CDPK家族成员的N-端可变区、激酶结构区、自抑区及EF-hand调控区4个保守结构域以及其他激酶成员的激酶结构域。同时,分别有21个与24个CDPK及相关激酶可能发生N-豆蔻酰化与N-十六烷酰化的修饰。染色体定位表明,小桐子CDPK及相关激酶基因不均匀地分布于10条染色体上,且存在JcCDPK7/JcCDPK9串联复制现象。转录组表达分析表明,29个CDPK及相关激酶基因中,有24个基因在叶片、根及种子中都有表达,而JcCDPK3、JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK属于低温诱导高表达基因,与小桐子的抗冷性直接相关。     

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。