Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NB/04株全基因组分子特征分析

对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome viurs, PRRSV）分离株NB/04的全基因组序列测定与分析。该毒株基因组全长15408bp,包含9个开放式阅读框,5’Untranslating Region(UTR)含有189nt,3’UTR含有150nt,其中包含28个Poly（A）。基因组序列分析结果表明,该毒株的Nsp2存在3个核苷酸缺失,3’UTR缺失一碱基。通过与国内外美洲型PRRSV分离株比对分析可知,非结构蛋白区的Nsp2和结构蛋白区的ORF5变异率最大。特别是Nsp2与国内主要分离株的氨基酸相似性在79.3%-96.4之间,ORF5与国内主要分离株的相似性介于86.1%-95.5%。依据Nsp2的推导氨基酸序列进行的系统进化分析可知,NB/04属于北美洲基因型,与BJ-4属于同一分支,而与中国标准株Ch-1a分属于不同的分支,表明浙江PRRSV已发生较大的变异。本研究结果丰富了我国PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传变异与生物学特性之间的关系奠定了基础。     

杯状病毒复制酶的结构与功能

本文综述了近年来有关杯状病毒RdRp的结构和功能的研究进展,并对与RdRp可能发生相互作用的伴侣分子进行了综述.此外,我们还讨论了所有杯状病毒的RdRp中可能存在的保守结构基序.     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

断奶仔猪多系统衰竭综合症发病机理的研究进展

断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）是由2型圆环病毒（PCV2）引起猪的一种疾病。PMWS的主要病理特征是淋巴细胞衰竭。目前认为PMWS的发病机理与免疫系统有关。在此,就目前关于PCV2—PMWS—免疫系统三者之间关系的研究进展和未来主要的研究方向作一综述。     

猪圆环病毒Ⅱ型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)Ⅱ型的基因组序列为材料,采用Gamier-Robson方法、Chou-Farplus 方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数.然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位.结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构.分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视.本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据.     

猪圆环病毒II型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)II型的基因组序列为材料,采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数。然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构。分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视。本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据。     

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。本研究进一步证实CH_1a株在基因型上属于北美洲型     

转译过程中小RNA病毒与宿主细胞的相互作用

小RNA病毒的转译机制不同于真核细胞mRNA的转译机制,该类病毒是借助于内部核糖体进入位点来启动内部翻译过程的,同时还伴随着宿主细胞蛋白质合成的抑制过程.在此过程中,小RNA病毒与宿主细胞间发生了一系列复杂的相互作用和信息交流,本文对该领域的研究进展作了综述.