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试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。 相似文献
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为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料(共3 035份)进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。 相似文献
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根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等3种病毒基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV VP2、PRV gB、PCV2 ORF1基因的保守区为各病毒的诊断靶序列.在建立各病毒单重PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了三种病毒的多重PCR技术.用78份临床病料对本研究多重PCR技术和单重PCR技术进行对比验证,结果显示,总符合率为97.4%以上.该方法特异性强、敏感性高,为PPV、PRV和PCV2临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段. 相似文献
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试验根据猪链球菌2型荚膜多糖(CPS)抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×101拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。 相似文献
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将传染性支气管炎病毒(IBV)ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP—C2中,成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色(ICC)结果显示,抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞,表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明,S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内,而胞核中未见分布,提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。 相似文献
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