无乳链球菌LIP蛋白的截短表达及免疫保护性研究

为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32a-LIP342在BL21(DE3)中获得了良好的可溶性表达,分子质量约为30 kDa,纯化使LIP342纯度由41.75%提至87.23%;Western blotting分析显示,LIP342可被兔抗无乳链球菌高免血清特异性识别;LIP342在目前已知不同种属来源或不同血清型的无乳链球菌分离株中同源性为90.35%~100%,在罗非鱼源分离株中同源性为100%;无乳链球菌LIP342蛋白和灭活疫苗均可显著提升奥利亚罗非鱼和大菱鲆血清抗体水平,而LIP342诱导的血清抗体水平均显著高于灭活疫苗;经0.1 mL 1×10~9cfu/mL的无乳链球菌攻毒后,LIP342蛋白和灭活疫苗对供试鱼的累积存活率均显著高于PBS对照组。结果表明,高度保守的LIP342具有较好的免疫原性,可作为无乳链球菌亚单位疫苗候选因子。     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK双抗原DNA疫苗的免疫保护效果观察

将构建的含鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)CDPK和3-1E双抗原的真核重组质粒proEC,在14日龄和21日龄分别免疫AA肉鸡,28日龄感染5×104个E.tenella孢子化卵囊,观察其免疫保护效果.结果显示,攻虫后1周,与proC组相比,proEC组能显著增强淋巴细胞转化和血清抗体水平(P＜0.05);与proE组和proC组相比,proEC组卵囊产量最低但差异不显著(P＞0.05),其相对增重低于proE组和proC组.结果表明,proEC双抗原DNA疫苗对E.tenella攻虫表现出一定双抗原协同保护效应.     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

猪链球菌保护性抗原表位串联亚单位疫苗设计及小鼠免疫保护效力分析

为了筛选和鉴定猪链球菌3个保护性抗原GAPDH、MRP、DLDH的优势B细胞抗原表位,设计表位串联方案,研究重组串联表位蛋白(简称GMD蛋白)免疫小鼠后对猪链球菌攻击的免疫保护效力。采用生物信息学分析工具对优势B细胞抗原表位进行筛选,并将表位串联并构建重组质粒pET28a-GMD,诱导表达且纯化后将GMD蛋白配合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,并评价该蛋白对2型猪链球菌的免疫保护效力。发现经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白大小为43.3 kDa;小鼠免疫保护实验结果显示,免疫小鼠血清中针对猪链球菌HA9801菌株抗体效价最高可达1∶102 400,GMD蛋白对小鼠的免疫保护率可达90%。上述结果表明面对猪链球菌HA9801菌株的攻击,GMD蛋白可以为机体提供良好的免疫保护,本研究结果为猪链球菌新型表位亚单位疫苗的研制提供了基础数据。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

重组铜绿假单胞菌外毒素A的原核表达和多克隆抗体制备及免疫保护功能分析

为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有很好的特异性;小鼠免疫保护试验结果表明,ETA对铜绿假单胞菌感染的保护率达50%,显著高于对照组的免疫保护率。用DNAman软件对ETA序列同源性进行分析,发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌,铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性;用MEGA软件对ETA的进化分析结果表明,不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌,据此可推测ETA免疫动物产生的特异性抗体可能为不同种类铜绿假单胞菌的感染提供交叉免疫保护。     

拟态弧菌外膜蛋白OmpU 基因的原核表达及其免疫保护性研究

自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEx-4T-1-OmpU.将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9 kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性.用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×103CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15).表明OmpU是拟态.弧菌的保护性抗原之一,具有研发成为外膜蛋白基因工程亚单位苗的潜在价值.     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗诱导小鼠免疫保护效果的观察

重组表达猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子基因:apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ、apxⅣ、apfa和omp,以重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合免疫小鼠作为试验I组,重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢr、OMPr、ApxⅣ和rApfa组合免疫小鼠作为试验Ⅱ组,PBS为对照组,分3次免疫小鼠,采用背部皮下多点注射,每次间隔2周,免疫剂量为0.2 mL/只,3免后1周分别以APP1型菌Shope 4074株(5×109cfu)和APP2型菌S1536株(5×1010cfu)进行攻毒试验。通过小鼠保护率与抗体效价的相关性研究、肺部病理变化及肺脏细菌的分布情况等指标进行综合评价。结果显示,试验Ⅰ组4种重组蛋白特异性抗体水平显著高于其他两组(P<0.05),对APP1型菌攻毒的保护率(9/10)明显高于试验Ⅱ组(5/10)和对照组(0/8),小鼠的免疫保护率与抗体效价之间存在显著正相关;且该组对APP2型菌攻毒的保护作用(无肺脏损伤)也明显优于其它两组(典型肺部损伤)。间接免疫荧光试验表明试验Ⅰ组对肺脏细菌的清除效果也明显优于其他两组。本试验揭示试验Ⅰ组对不同血清型APP攻击能够提供很好的交叉保护作用,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。     

加味玉屏风汤对免疫抑制小鼠免疫器官的保护效应

应用动物试验和病理组织学方法,研究了传统中药方剂加味玉屏风汤对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠脾和胸腺等免疫器官的保护作用。结果表明,加味玉屏风汤能明显拮抗环磷酰胺所致脾白髓、骨髓造血组织和胸腺淋巴细胞容量下降（Ｐ〈０．０１）,能显著升高下降的胸腺和脾指数（Ｐ〈０．０１）及减少的外周血白细胞和体重（Ｐ〈０．０１）;同时对健康小鼠以上指标也有不同程度的促进作用,提示加味玉屏风汤对脾和胸腺等免疫器官具有一定的