CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母gpd2基因对产2,3-丁二醇的影响

旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2),探究其对2,3-丁二醇产量的影响。根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W5甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd2)设计供体片段及gRNA片段,将gRNA片段与可表达Cas9蛋白的敲除载体相连,之后将重组质粒及供体DNA片段转化到S. cerevisiae W5细胞中,根据表型筛选及PCR验证获得gpd2基因缺失菌株。结果表明目的基因gpd2敲除成功,基因缺失菌株与原始菌株经发酵实验相比,甘油产量下降22.01%,乙醇产量提高24.65%,2,3-丁二醇产量下降10.60%。gpd2基因的敲除并没有提高2,3-丁二醇的产量,原因可能是逐渐积累的NADH会优先被细胞内大量的乙醇脱氢酶所氧化,作用于乙醇的产生,而不是优先作用于2,3-丁二醇的合成。本实验构建了适用于酿酒酵母的基因敲除系统,该系统对进一步探究酿酒酵母其他代谢产物与2,3-丁二醇合成之间的关系具有实际的借鉴意义。     

组蛋白甲基化对酿酒酵母铁离子代谢平衡基因表达的影响

为了解组蛋白化学修饰在铁离子代谢平衡相关基因表达调控中的作用,在酿酒酵母中通过敲除铁硫簇合成基因YFH1激活铁离子代谢平衡相关基因,并在此基础上敲除组蛋白甲基化酶基因,然后通过RNA测序检测组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡相关基因激活中的作用。结果显示,酿酒酵母中组蛋白甲基化的缺失并没有显著影响铁离子代谢平衡通路相关基因的激活,表明组蛋白甲基化在铁离子代谢平衡基因的激活调控中并不是必须的。     

饲粮添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能与瘤胃发酵的影响

【目的】研究饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能和瘤胃发酵的影响,为酿酒酵母和地衣芽孢杆菌在肉羊饲粮中的合理应用提供理论依据。【方法】试验选用48只4月龄、体重相近（22.96±2.00）kg、健康的杜泊×小尾寒羊杂交F₁代公羔,根据饲喂添加剂不同随机分为4组：D（对照组,两种菌均不添加）;D1（酿酒酵母,6×10¹⁰CFU/kg）;D2（地衣芽孢杆菌,2×10¹⁰CFU/kg）;D3（酿酒酵母6×10¹⁰CFU/kg+地衣芽孢杆菌2×10¹⁰CFU/kg）,每组12只羊,试验期共75 d,前15 d为适应期,正饲期60d。试验羊每天分别于08:00和18:00进行饲喂,自由采食和饮水。正饲期内每天准确称量记录每只试验羊的喂料量和剩料量,并在第1、30、60 天晨饲前对试验羊进行称重,计算平均日采食量、平均日增重（ADG）及料重比（F/G）。试验结束当天08：00正常饲喂试验羊,3 h后采集瘤胃液,测定发酵参数、消化酶活性以及功能微生物。【结果】1）饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对试验羊的初始体重和终末体重及平均采食量的影响均不显著（P>0.05）,D3组的ADG显著高于D组（P<0.05）,D3组的F/G显著低于D组（P<0.05）,D1和D2组的F/G差异不显著（P>0.05）;2）饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对瘤胃液pH、丁酸浓度及乙丙比的影响均不显著（P>0.05）,D3组的NH₃-N浓度显著低于D组（P<0.05）,TVFA和丙酸浓度显著高于D组（P<0.05）,且D3组与D1和D2组均差异不显著（P>0.05）,D3和D2组的乙酸浓度显著高于D1与D组（P<0.05）;3）D3组的β-葡萄糖苷酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶及淀粉酶活性均显著高于其他3组（P<0.05）。D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶及淀粉酶活性与D组无显著差异（P>0.05）。D3组蛋白酶活性显著高于D和D2组（P<0.05）,与D1组差异不显著（P>0.05）,D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶及淀粉酶活性均差异不显著（P>0.05）;4）添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对黄色瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和原虫数量的影响不显著（P>0.05）,D3组的溶纤维丁酸弧菌数显著高于其他3组（P<0.05）,白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌显著高于D组（P<0.05）,但与D1和D2组差异不显著（P>0.05）。与对照组相比,试验组产甲烷菌数量显著降低（P<0.05）,其中D3组最低。【结论】饲粮中添加6×10¹⁰CFU/kg酿酒酵母和2×10¹⁰CFU/kg地衣芽孢杆菌均会对绵羊瘤胃发酵产生积极影响,提高了瘤胃消化酶的活性,增加了瘤胃有益菌的数量,且二者组合饲喂效果更加显著。     

富铁酿酒酵母菌株的选育及其培养条件优化

【目的】分离鉴定高效富铁酿酒酵母菌株,优化其培养基组分和发酵条件。【方法】从果园根际土壤中分离选育耐铁酿酒酵母菌,对其进行形态学、生理生化分析和26 S rDNA基因序列分析鉴定;采用单因素试验,分别设置不同碳源种类（葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖）、氮源种类（硫酸铵、酵母膏、蛋白胨、尿素）及不同质量浓度Fe²⁺（100,200,300,…,1 000,1 200,1 600,2 000 μg/mL）、碳源（10,20,30,40,50,60,70,80,90 g/L）、氮源（无机氮源 2,4,6,8,10,20 g/L;有机氮源 4,8,12,16,20,24,28 g/L）、无机盐（MgSO₄·7H₂O 0.3,0.5,1.0,1.5,2.0 g/L;KH₂PO₄ 0.5,1.5,2.5,3.5,4.5 g/L）的培养基进行试验,探究不同培养基组分对酿酒酵母富铁能力的影响。采用单因素试验研究温度（26,28,30,32,34,36,38 ℃）、初始pH值（3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5）、接种量（2%,4%,6%,8%,10%,12%）、转速（140,160,180,200,220 r/min）、装液量（250 mL三角瓶中分别装20,30,40,50,60,70 mL）对酿酒酵母富铁能力的影响。选择温度、初始pH值、接种量、转速进行L₉(3⁴)正交试验设计,获得最佳发酵培养条件,并进行验证试验。【结果】从三叶木通果园土壤中分离鉴定获得1株耐铁酿酒酵母菌株ZY-JM16,通过单因素试验,获得该菌株最优培养基组成为：蔗糖50 g/L、尿素4 g/L、酵母膏24 g/L、KH₂PO₄ 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、Fe²⁺ 900 μg/mL(FeSO₄·7H₂O 4.5 g/L);通过单因素试验和正交试验优化,发现该菌株高富铁率最佳发酵条件为：起始pH值4.8、温度28 ℃、转速180 r/min、接种量6%、装液量50 mL（250 mL锥形瓶）,发酵时间为40 h。在此条件下,该菌株铁富集率达到91.80%,较优化前提高了229.27%;菌体生物量达13.06 g/L,较优化前提高了59.07%。【结论】获得1株高效富铁酿酒酵母菌ZY-JM16,对其培养条件进行了优化,明晰了其生长规律。     

酿酒酵母细胞壁可通过TLR2受体调控绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1

旨在研究酿酒酵母细胞壁对体外培养绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响及其调控途径,为揭示酿酒酵母细胞壁对机体免疫的调控机制提供理论依据。本研究将不同质量浓度的酿酒酵母细胞壁提取物(0,25,50,100,200,400mg/L)作用于绵羊瘤胃上皮细胞不同时间(0,2,4,8,12,24h)后,检测上皮细胞SBD-1和Toll样受体-2(TLR2)mRNA表达水平,并进一步通过TLR2阻断试验来证实TLR2是否介导酵母细胞壁促进SBD-1表达。结果表明,不同浓度的酵母细胞壁刺激瘤胃上皮细胞时,随着细胞壁浓度的增加SBD-1mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,且酿酒酵母细胞壁质量浓度为200mg/L刺激12h时,SBD-1 mRNA表达量达到峰值,与对照组和其他时间组相比差异显著(P0.05);用质量浓度为200mg/L的酿酒酵母细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞不同时间,同样在12h时,TLR2的mRNA表达量达到最大;阻断试验表明TLR2可介导SBD-1的表达。本研究结果表明酿酒酵母细胞壁可促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且质量浓度200mg/L时,刺激瘤胃上皮细胞12h时SBD-1的表达量达到最高,而TLR2参与该调控过程。     

新型酿酒酵母培养物对蛋鸡生产性能和蛋品风味特征的影响

试验旨在探讨日粮中添加新型酿酒酵母培养物对蛋鸡生产性能和蛋品风味特征的影响。选取900只180日龄的罗曼粉蛋鸡,随机分成三组,每组5个重复,每个重复60只鸡,分别饲喂3种不同的日粮:Ⅰ为对照组基础日粮,Ⅱ组和Ⅲ组分别饲喂添加2%、4%新型酿酒酵母培养物的日粮,试验周期为15周。结果表明:与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组平均蛋重均显著增加(P<0.05),死淘率均极显著降低(P<0.01),Ⅲ组料蛋比显著降低(P<0.05);应用电子舌和电子鼻现代电子感官系统分别检测两组鸡蛋的滋味特征及气味特征,Ⅱ组、Ⅲ组熟蛋黄和熟蛋清苦味回味均极显著降低(P<0.01),Ⅲ组熟蛋黄鲜味丰富度显著增加(P<0.05),熟蛋清鲜味丰富度极显著增加(P<0.01);熟蛋黄气味特征变化不明显,但Ⅲ组熟蛋清气味特征发生显著变化。因此,日粮中添加4%的新型酿酒酵母培养物可提高蛋鸡的生产性能,改善蛋品风味特征。     

酿酒酵母Y2发酵特性研究

本研究对酿酒酵母Y2的发酵特性进行了测定,结果表明,菌株Y2的最适生长温度为28℃,OD值达到1.97;最适生长pH为6.0,O D值为2.12;最适发酵温度为30℃;CO 2失重达9.5g;在酒精度浓度为16%时,菌株的死亡率为85.2%;在pH1.5时,菌株的OD值为0.55。综上所述,菌株Y2能够很好地适应苹果酒的酿造环境,适宜用作果酒的酿造。     

棉粕源生物蛋白饲科料发酵工艺参数的优化

为了优化棉粕源生物蛋白饲料二元复合发酵工艺参数,试验采用二因子重复设计方法,测定发酵产物中游离棉酚(free gossypol,FG)含量,确定优化热带假丝酵母(Candida tropicalis ZD-3)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ZD-5)对棉粕源基础底物复合发酵的接种量和接种...     

表达鸡α干扰素重组酿酒酵母菌的构建与鉴定

通过构建鸡α干扰素真核表达载体,以获得能够表达鸡α干扰素的酵母工程菌株。首先根据GenBank公布的鸡α干扰素基因序列设计上、下游引物,以略阳乌鸡基因组DNA为模板,PCR扩增鸡α干扰素基因片段。然后,利用基因重组技术将鸡α-干扰素基因插入真核表达载体,通过菌落PCR和DNA测序确定目标载体,构建成功后转化至酿酒酵母AH109,再通过营养缺陷培养、质粒提取和PCR鉴定带JMB440-ChIFN-α载体的重组酵母菌株。最终通过酵母培养、总蛋白收集、SDS-PAGE电泳和Western blot等,确定鸡α干扰素基因能够与酵母菌株重组,并表达α干扰素,蛋白条带大小约为23ku,与预期结果一致,表明成功构建了表达鸡干扰素基因的工程酵母菌株。