可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

16种微生物蛋白酶的生物信息学分析

蛋白酶(protease)是以降解蛋白质为主的糖苷酶,具有丰富的多样性,在生物有机体中发挥着重要而又广泛的作用,具有广泛的研究和应用价值。本研究采用ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1 server和NPSA serve等生物信息学软件,对天蓝色链霉菌、普通拟杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等16种微生物蛋白酶的理化性质、蛋白结构、系统发生树和功能域等进行了分析。结果表明:通过分析16种微生物蛋白酶的稳定性发现,金黄色葡萄球菌、唾液链球菌、短小芽孢杆菌、绿脓杆菌为不稳定蛋白;二级结构由α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成;除了节杆菌属、无乳链霉菌、普通拟杆菌、肠杆菌属具有信号肽,其余蛋白酶氨基酸序列不具有信号肽的特点。可以推测出蛋白酶为非分泌性蛋白;只有绿脓杆菌和猪链球菌有跨膜结构,剩下其余几种微生物均没有跨膜结构。具有2个蛋白功能域,分别为Peptidase S8 familyi、Fn3_5like domain。     

猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。     

全细胞催化剂pelB⁃Xln⁃DT构建及其在水解三七皂苷R1中的应用

设计带有EcoRV和XhoI酶切位点的上下游引物PCR扩增嗜热菌Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的GH39家族的β-木糖苷酶Xln-DT编码基因,利用基因拼接技术将其重组至p ET-20b质粒中pelB信号肽基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21,构建分泌融合表达型基因工程菌pelB-Xln-DT。经异苯基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,pelB-Xln-DT酶活为2.1 U/m L。粗酶液pelB-Xln-DT的最适温度为85℃,较原酶提高了10℃,最适p H为5.5,比原酶降低了0.5; pelB-Xln-DT在85℃下的热稳定性比原酶有了一定提高,保温1 h后酶活基本不变,保温2 h其剩余酶活为82.0%,而Xln-DT在85℃下保温1 h后其剩余酶活为70.4%;在p H 4.0～7.0的范围内,pelB-Xln-DT具有良好的p H稳定性。引入pelB信号肽后不但能够提高蛋白的可溶性表达,还能提高酶蛋白的热稳定性。以pelB-Xln-DT作为全细胞催化剂转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1,研究了转化温度、转化时间、三七皂苷R1添加量、重复次数等因素对转化效率的影响。结果表明,全细胞催化剂用量1.0 U/m L,在温度37℃下,3 g/L的三七皂苷R1反应3 h后的摩尔转化率达到91.6%,重复利用10次后,转化率仍能达到46.7%,显示出pelB-Xln-DT良好的重复催化性能。     

以谷蛋白GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累

提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种子中最主要的贮藏蛋白,其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,本研究克隆了水稻谷蛋白Glu A-2基因的启动子及其信号肽编码序列,并与GUS报告基因编码区融合,构建了分别含有和不含有信号肽的表达载体p13GG和p13GSG;经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中,获得了20多个独立转化子,PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明,融合Glu A-2信号肽编码序列可显著提高GUS基因在水稻胚乳中的转录;利用GUS特异的抗体进行Western杂交分析,显示该信号肽序列可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累,但是其所指导表达的GUS蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性,其机制有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有重要的指导作用。     

羊布鲁氏菌16M基因组分泌蛋白的生物信息学分析

对羊布鲁氏菌全基因组16M中全部3 197个氨基酸序列进行生物信息学分析.利用SignalP和TatP软件分析N-端信号肽,结果显示具有N-端信号肽的序列有288个;继而用TMHMM和Phobius软件对这288个序列进行跨膜区预测,得到不含跨膜区的蛋白208个;最后利用LipoP对这208个蛋白进行分类,得到具有信号肽的蛋白191个.使用SecretomeP软件对被预测为无信号肽的蛋白质进行分析,结果显示有391个可能通过非经典途径分泌.由于分泌蛋白在细菌的致病过程中起着重要作用,而布鲁氏菌基因组编码的大多数蛋白的功能尚未确定,因此分析和预测布鲁氏菌的分泌蛋白可为更完整地、系统地研究布鲁氏菌的分子致病机理提供非常重要的信息.     

农杆菌VirD2蛋白的定位特异性改造

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)VirD2蛋白具有与单链T-DNA(ssT-DNA)共价结合并将其转运至植物细胞核,将外源基因高效整合进核基因组的功能;如果将该蛋白改定位于质体,则有可能利用其将外源基因携带进质体,建立质体转化新方法.本研究对VirD2蛋白的定位信号进行了改造,采用重叠延伸PCR突变技术对Vir2的N端核定位信号(NLS)编码序列进行点突变,对C端编码序列实施缺失突变,并在合成的突变VirD2(mVirD2)基因3’端连接上增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因,在其5’端加上或不加源自拟南芥(A rabidopsis thaliana)冷调节基因(AtCOR15A)的质体定位信号肽编码序列,分别构成pt-mVirD2-eGFP和mVirD2-eGFP嵌合基因,由CaMV 35 S启动子控制,经农杆菌介导整合进烟草(ic otiana tab ac um)核基因组.荧光检验显示,mVirD2带质体定位信号时绿色荧光集中于叶绿体,mVirD2不带质体定位信号时绿色荧光弥散在细胞质中,且两者的细胞核均无荧光,表明pt-mVirD2-eGFP嵌合基因表达的蛋白具有质体定位特性,并失去了核定位能力.该结果为今后探讨利用pt-mVirD2融合蛋白将外源DNA主动定向牵引进质体,实现质体高效转化研究提供基础资料.     

大熊猫IL-4基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析*

 利用信号肽分析软件SignalP v3.0,亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1.01,GPI-锚定位点软件big-PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2.0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为78bp,最大值为7849bp,平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15～45个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述,主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类,提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.