里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN II)的cDNA序列。测序结果表明,XYN II的cDNA基因开放阅读框长度为669 bp,编码223个氨基酸,N端1~19个氨基酸为潜在的信号肽序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xynII)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYN II并分泌到胞外。发酵液中的酶活在诱导培养60 h达到1.45 IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0。     

耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用

为寻求具有耐热性能的木聚糖酶,笔者以嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)DSM3960的基因组为模板,克隆得到木聚糖酶基因xyn B-DT,该基因全长1 083 bp,共编码361个氨基酸,蛋白的理论分子量约为40ku。通过NCBI数据库比对发现该基因编码的蛋白质属于糖苷水解酶G11家族。实现大肠杆菌异源表达重组木聚糖酶Xyn B-DT,通过IPTG诱导,酶活达到30.6 U/mL。该重组木聚糖酶的最适温度为85℃,在60~80℃范围内均有较好温度稳定性,在60℃条件下保温2 h,酶活维持在90%以上,在90℃下保温2 h,酶活尚残余约50%;最适pH为6.5,在pH为5.0~7.5范围内保温24 h仍可保留约90%剩余酶活力。该酶以Beechwood木聚糖为底物,米氏常数(K_m)和最大反应速率(V_(max))值分别为5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min~(-1))。以玉米芯木聚糖为底物,研究XynB-DT水解玉米芯木聚糖的条件及产物,结果显示在温度70℃、pH 6.0条件下酶解12 h,加酶量为400 U/g,最终酶解得率为44.3%,玉米芯木聚糖的水解产物主要以木二糖和木三糖为主,表明该木聚糖酶在低聚木糖制备方面具有较大应用潜能。     

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。     

里氏木霉木聚糖酶XYNⅡ基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0.     

偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色

【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础。【方法】将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定。利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应p H值及p H稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值。研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力。【结果】串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(Gen Bank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白。Lg-MnP1的表观分子量为45.39 k Da,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,p H超过4.5反应程度就迅速下降,在p H为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L~(-1)。L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%。纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%。【结论】SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大。L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶液对中性红、刚果红和结晶紫的降解效率要远高于同时含有菌丝、漆酶和MnPs的培养液。     

三七花总皂苷的微波辅助提取

三七花是三七全株中三七皂苷含量最高的部分,三七花的药理作用远强于人参花。研究了浴液温度、微波功率、提取时间、原料粒度、溶剂配比等因素对三七花中总皂苷提取收率的影响规律,获得了微波辅助提取三七花中总皂苷的工艺技术条件。最适工艺条件为:微波功率为500 W,三七花粉原料粒度为60目,50%乙醇水溶液为溶剂,浴液比为10 mL/g,浴液温度为65℃。总皂苷提取收率为16.14%。微波辅助提取三七花中总皂苷具有加热效率高、节能省时、节省溶剂、污染小等特点。     

优化彩绒革盖菌产漆酶条件及染料脱色研究

对一株漆酶高产白腐菌———彩绒革盖菌的培养和产酶条件,包括培养基初始pH值、金属离子Cu2 和Mn2 的含量,以及诱导剂的种类、添加量和添加时间等相关因素进行了优化。结果发现该菌种适宜在pH值3.5~5.7环境下生长并合成漆酶,培养基中添加缓冲液可以获得更高的酶活,但不加则有较高的酶产率;铜和锰可以显著提高漆酶活力,当以0.1 mmol/L 2,5-二甲基苯胺为诱导剂时,培养基中宜含0.008~0.08 mmol/L Cu2 ,0.01 mmol/L左右的Mn2 。在5种常用漆酶诱导剂中,2,5-二甲基苯胺的效果最佳,且应在菌种进入对数生长期时加入效果最好,其最适添加浓度为0.4 mmol/L,此时最适产酶Cu2 浓度为0.4 mmol/L。研究显示漆酶在30和40℃下保持6 h后残余酶活分别为原来的95%和80%;60℃条件下,该酶保温1 h后的残余活力仅为原来的14%。该酶的最适反应温度是65℃,最适反应pH值为2.4~3。对20种常用染料进行的脱色研究显示,在pH值5、40℃条件下,该粗漆酶液可以直接作用于13种工业染料。     

栽培年限对东北人参中皂苷合成基因表达量的影响

以不同栽培年限的东北人参为材料,对其皂苷生物合成途径中各关键酶基因表达量进行研究,结果表明:SS、SQE1、SQE2、β-AS和CAS基因表达量在2 a生时均达到峰值,之后呈现下降趋势。在相关性分析中,SS、SQE1、β-AS和CAS四种基因表达量呈显著正相关(p0.05);SS基因和SQE1基因、SS基因和CAS基因、SQE1基因和CAS基因的表达量呈极显著正相关(p0.01);而β-AS、CAS和SQE2三种基因的相关性亦达到显著水平(p0.05)。     

巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶的表达纯化及定向进化研究

为了获得高效的重组来自巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450酶(CYPs),将CYPs基因(cyp)克隆到大肠杆菌表达载体p ET20b(含T7启动子)和p Trc99A(含trc启动子)中,转入大肠杆菌表达,发现trc启动子更适合CYPs的表达。优化了Ni-NTA纯化CYPs的条件,在p H值8.1时,用60 mmol/L的咪唑缓冲液洗脱得到电泳纯的重组CYPs,酶活达到2 095 U/mg,纯化回收率为31%,回收倍数为2.32。通过理性设计确定突变位点为269位苏氨酸(T)和394位苯丙氨酸(F),通过筛选获得了突变酶T269S和T269R,2种突变酶以软脂酸为底物,酶活提高32.0%和29.0%,以油酸为底物酶活提高11.6%和9.1%。     

桑粒肩天牛幼虫内切-β-1,4-葡聚糖酶的纯化及性质

经丙酮沉淀、UltrogelAcA5 4凝胶过滤、Q Sepharose离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶制备电泳 ,发现桑粒肩天牛幼虫肠液中具有所有水解纤维素成分的三种消化酶 ,并且每种酶都有不同数目的同工酶。纯化出一种内切 - β- 1 ,4 -葡聚糖酶 (EG - 1 ) ,其分子量为 2 6ku ,等电点约为pI4 0。酶的最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH为5 2 ;不耐热 ,5 0℃处理 30min ,酶活大大降低 ,70℃处理 2h ,几乎丧失全部活性 ,显示出该酶适合动物肠道反应环境 ,是内源性酶。     

无患子叶皂苷提取及结构表征

以无患子叶子为研究对象,分别考察了索氏抽提法与微波萃取法对皂苷提取得率的影响,确定了较优的提取工艺.结果表明,索氏抽提选择80％乙醇为提取剂,在液料比30∶1(g∶g,下同),提取温度95℃,抽提时间为3h,提取2次时皂苷元提取得率达到21.7％；微波萃取选择3 g原料,微波功率300 W,温度70℃,90％的乙醇,液料比20∶1,提取时间45 min,皂苷的提取得率达到22.3％.目标提取物经IT-IR、HPLC和1H NMR表征,确定其结构为常春藤皂苷元.     

来源于解酯菌的嗜热耐碱脂肪酶的表达纯化及其酶学性质研究

脂肪酶广泛应用于食品加工、生物柴油制备等领域。为了有效提高微生物脂肪酶的可利用度,将来源于解酯嗜热菌(Thermosyntropha lipolytica DSM 11003)的脂肪酶基因(tll2)克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a TLL2,将pET28a TLL2转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行高效表达。通过热处理和镍柱亲和层析得到电泳纯的蛋白TlLip2,对其进行酶学性质表征。结果显示,TlLip2的亚基分子质量为57 ku,比酶活为31 U/mg,最适反应pH及温度分别为8.0和60℃。在60℃以下、pH 6.0~11.0范围内,TlLip2的稳定性较好,相对酶活均维持在60%以上。金属离子K+和Na+对TlLip2有较大激活作用,而Co^2+、Zn^2+、SDS和Tween 80对TlLip2酶活力抑制作用明显。TlLip2在极性小的有机溶剂中具有较好的耐受性。TlLip2对中等碳链长度的对硝基苯酯显示出更高的活性,其中以对硝基苯己酯为底物时,TlLip2的酶活最高;以对硝基苯棕榈酸酯为底物时,该酶的动力学常数Km为0.29 mmol/L,Vmax为2.28 mmol/(L·min^-1),kcat为6.19 s^-1。此外,将其应用到油酸乙酯的合成研究中,以油酸和乙醇为底物,研究TlLip2催化制备油酸乙酯的转化条件,结果表明在60℃、加酶量为100 U/g的TlLip2,催化摩尔比为1∶2的油酸和乙醇,12 h后油酸乙酯的转化率达到62.1%,表明TlLip2在催化脂肪酸酯化方面具有较大的应用潜能。     

蛹虫草固态发酵转化西洋参中人参皂苷的研究

研究蛹虫草发酵西洋参中人参皂苷转化规律。采用超高效液相色谱法,比较不同发酵时间西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rg1,Rb2,Rb3,Rc ,Rd的含量;结果表明,蛹虫草菌种产生的酶系可使人参皂苷Rg1转化为Rd ,且专一性较好;此方法为人参皂苷Rd生物转化提供一种新途径。     

优化培养条件对提高香菇漆酶产量的研究

对香菇发酵产漆酶条件进行了优化并研究了部分漆酶性质。结果发现静置培养优于振荡培养;pH值≥5.6时香菇菌体基本无法生长,香菇最适生长及产酶pH值为3.5;20℃低温有利于香菇漆酶生长,但最适产酶温度是25℃;Cu2 浓度为0.2~1.0 mmol/L时有利于香菇漆酶的合成,其中0.4 mmol/L是香菇产漆酶的最佳铜离子浓度,当铜离子终浓度超过5 mmol/L时,严重抑制香菇菌丝的生长;除了2,5-二甲基苯胺之外,阿魏酸、愈创木酚、没食子酸、黎芦醇等诱导剂促进香菇合成漆酶的作用不明显,反而会抑制菌丝生长;Tween-80的加入不利于漆酶合成。香菇漆酶在60℃条件下保温1 h后仍残余了2%的活力;以2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物的最佳反应温度是65℃,最适反应pH值为2.2(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系)。     

黑曲霉固态发酵产阿魏酸酯酶及酶解麸皮制备阿魏酸

阿魏酸是一种广泛存在于植物细胞壁中的羟基肉桂酸,在医药、食品等行业具有巨大的应用前景。笔者选取黑曲霉菌株TRIIM 3.00954固态发酵产生阿魏酸酯酶,并研究了其酶学性质和酶解麸皮制备阿魏酸的能力。结果表明,以麦麸和甘蔗渣质量比2∶1混合作为基质,添加0.6%葡萄糖作为补充碳源,1.0%尿素为补充氮源,初始p H 6.0,30℃发酵培养7 d后,获得的阿魏酸酯酶产量最高为8.2 U/g。粗酶液中阿魏酸酯酶最适温度和p H分别为50℃和5.0。以0.6 U/g的阿魏酸酯酶和90 U/g的木聚糖酶联合作用去淀粉麸皮,50℃和p H6.5下酶解6 h,最终可将去淀粉麦麸中60.6%的阿魏酸释放出来。利用农林加工副产物提取酚酸类物质、提升产品附加值是近年研究热点,本研究建立的阿魏酸酯酶发酵及酶法制备麦麸阿魏酸的技术,为工业化提取阿魏酸提供了有效途径。     

大孔吸附树脂纯化常春藤皂苷C工艺研究

通过静态吸附试验比较7种树脂对常春藤皂苷C的吸附与解吸,筛选出效果最佳树脂,通过动态吸附试验对最佳树脂的上样p H、上样体积、洗脱液浓度、洗脱体积、洗脱流速进行优化。结果表明:HPD-100树脂对常春藤皂苷C的吸附与解吸性能最好,HPD-100树脂对常春藤皂苷C纯化的最佳条件为:上样体积为6BV,洗脱液乙醇浓度为80%,洗脱体积为7 BV,洗脱流速为1 BV/h。     

水酶法提取板栗壳棕色素工艺条件的筛选

为了确定水酶法提取板栗壳棕色素的工艺条件,以板栗壳为原料,通过单因素试验和正交试验,对其工艺条件进行筛选。结果表明,水酶法提取板栗壳棕色素的最适工艺条件为:复合酶总酶量2.0%,纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶质量比为2∶3∶5,酶处理p H值5.0,温度50℃,时间2.0 h,料液比1∶120。     

彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色的研究

采用彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)在液体深层发酵条件下产漆酶,优化后的最适工艺条件为:以1.1 g/L蔗糖与1.1 g/L葡萄糖作为复合碳源,氮源为1.88 g/L豆饼粉,初始pH值4.5,培养温度30 ℃,漆酶活力可达18.2 U/mL.漆酶的最适反应温度为60 ℃,在55 ℃以下酶活力均保持稳定.综合考虑漆酶作用的最适温度与热稳定性,确定该酶的适宜应用温度为55 ℃.利用粗酶液对染料酸性橙进行降解脱色试验,发现氧化还原介质可明显提高漆酶的催化能力,作用5 h最高脱色率可达96.5%,显示了漆酶在环境治理方面良好的应用前景.     

3,3-二甲基联苯胺法测定香菇漆酶活性研究

以邻联甲苯胺(3,3-二甲基联苯胺)为底物,采用分光光度法测定香菇(Lentinula edodes)漆酶(Laccase)的活性,对最佳反应条件进行了筛选和优化.结果表明:当以醋酸-醋酸钠为缓冲溶液体系进行酶活性测定时,最适pH值为4,最适温度为53 ℃.漆酶在30 ℃的条件下保温过夜活性仍能保持在90%以上,而高温条件下漆酶不稳定,容易变性失活.当缓冲溶液体系中二价铜离子质量浓度在50～60 mg/L之间时,漆酶活性约提高50%;而亚铁离子则可以完全抑制漆酶的活性.     

黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性。结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2×105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培养基组成为豆渣1%、米糠1%和Tween 800.1%,初始pH值5.5;菌株在发酵温度28℃、装液量50 mL(250 mL摇瓶)、摇床转速150 r/min的发酵条件下发酵120 h,发酵液酶活为(200±10)U/mL。所产β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的最适温度为55℃、最适pH值2.5、最佳水解时间15 min;在该条件下酶的表观米氏常数(Km)为1.35 g/L,最大水解速率(Vmax)为26.45 g/(L.min.mg),酶活半衰期为15 min,50℃时大于60 min;酶的水解活性受Na+、Ca2+的显著激活,受Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg+、Zn2+、Mn2+等离子(10 mmol/L)和葡萄糖、乙醇的抑制。