里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN II)的cDNA序列。测序结果表明,XYN II的cDNA基因开放阅读框长度为669 bp,编码223个氨基酸,N端1~19个氨基酸为潜在的信号肽序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xynII)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYN II并分泌到胞外。发酵液中的酶活在诱导培养60 h达到1.45 IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0。     

里氏木霉木聚糖酶XYNⅡ基因在毕赤酵母中的分泌表达

采用RT-PCR方法克隆到里氏木霉Rut C-30木聚糖酶(XYN Ⅱ)的cDNA序列.测序结果表明,XYN Ⅱ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp,编码223个氨基酸,N端1～19个氨基酸为潜在的信号肤序列,删去潜在信号肽序列,将里氏木霉木聚糖酶的基因(xyn Ⅱ)构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中,经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1%的甲醇进行诱导,对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1.45IU/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为6.0.     

纤维素酶基因表达研究进展

获得更高生产性能的菌株是降低纤维素酶在纤维乙醇、纸浆造纸、纺织等领域使用成本的主要解决途径。总结了影响宿主菌(里氏木霉和毕赤酵母)高效表达纤维素酶基因的多种因素,如里氏木霉转录调控、启动子优化、外源酶基因与毕赤酵母表达的适配性、启动子拷贝数及酶基因拷贝数等,以期为纤维素酶高产菌株的构建提供有益的参考。     

南极嗜冷杆菌脂肪酶的原核可溶性表达优化及酶学性能表征

脂肪酶广泛应用于食品加工、生物柴油制备等领域。为了有效提高微生物脂肪酶的可利用度,将来源于南极嗜冷杆菌属(antarctic psychrotrophic bacterium,Psychrobacter sp.7195)的嗜冷脂肪酶(Lip7195)在大肠杆菌系统中进行高效可溶性表达优化,并进行酶学性能表征。首先对Lip7195基因进行大肠杆菌偏好密码子优化,并通过添加多聚阳离子氨基酸标签等手段,优化重组Lip7195的可溶性表达。结果显示,添加多聚阳离子氨基酸标签的方法有效增加了目的蛋白的可溶性。对纯化后的重组酶进行酶学定性,结果显示,在40℃、p H 9.0时,重组Lip7195酶活性最高,比酶活最高达10.9 U/mg;在30~40℃、p H 8.0~10.0范围,重组Lip7195具有较好的稳定性;Co~(2+)对酶活力有激活作用。研究结果表明,在保持嗜冷脂肪酶特有的酶学性质基础上,添加多聚阳离子氨基酸标签有效改善了其在原核表达中易形成包涵体的问题。     

高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变

利用定向分离法从市场购得的苹果、梨、葡萄、面粉、酒糟、啤酒花等6个样品中分离出7株产脂肪酶菌株:曲霉1株,酵母6株.其中从面粉中分离出来的菌株MF具有较高的酶活力,粗酶活力达29.17 U·mL-1,经初步鉴定为假丝酵母(Candida sp.).对该菌株产酶条件进行优化可知:该菌的最佳碳源是1%的10: 1(m/V)的酵母膏+乳化液;最佳氮源为2%的3:1(m/m)玉米粉+蛋白胨;培养的最适初始pH值为8.0,最佳培养时间为72 h,最适反应温度为40℃,最佳反应时间为30 min.优化后的酶活力达41 U·mL-1,比优化前提高了40.5%.对MF菌株进行初步紫外诱变处理,突变菌株酶活力70.83 U·mL-1,比未处理的菌株的脂肪酶活力提高了105%.     

全细胞催化剂pelB⁃Xln⁃DT构建及其在水解三七皂苷R1中的应用

设计带有EcoRV和XhoI酶切位点的上下游引物PCR扩增嗜热菌Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的GH39家族的β-木糖苷酶Xln-DT编码基因,利用基因拼接技术将其重组至p ET-20b质粒中pelB信号肽基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21,构建分泌融合表达型基因工程菌pelB-Xln-DT。经异苯基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,pelB-Xln-DT酶活为2.1 U/m L。粗酶液pelB-Xln-DT的最适温度为85℃,较原酶提高了10℃,最适p H为5.5,比原酶降低了0.5; pelB-Xln-DT在85℃下的热稳定性比原酶有了一定提高,保温1 h后酶活基本不变,保温2 h其剩余酶活为82.0%,而Xln-DT在85℃下保温1 h后其剩余酶活为70.4%;在p H 4.0～7.0的范围内,pelB-Xln-DT具有良好的p H稳定性。引入pelB信号肽后不但能够提高蛋白的可溶性表达,还能提高酶蛋白的热稳定性。以pelB-Xln-DT作为全细胞催化剂转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1,研究了转化温度、转化时间、三七皂苷R1添加量、重复次数等因素对转化效率的影响。结果表明,全细胞催化剂用量1.0 U/m L,在温度37℃下,3 g/L的三七皂苷R1反应3 h后的摩尔转化率达到91.6%,重复利用10次后,转化率仍能达到46.7%,显示出pelB-Xln-DT良好的重复催化性能。     

重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究

利用聚合酶链式反应(PCR)技术从毕赤树干酵母的基因组中扩增得到木糖还原酶基因xyl 1和木糖醇脱氢酶基因xyl 2,它们分别或同时与高拷贝型酵母表达载体YEp 24重组,再经醋酸锂转化酿酒酵母,得到了3种不同类型的重组酵母菌株,其中重组酿酒酵母菌株NLR04可利用单一的木糖为碳源进行生长,并能够在微氧或厌氧环境中缓慢发酵木糖生成乙醇,乙醇得率可达到理论得率的37.0%.该研究可为微生物的木糖代谢工程提供种质资源.检测结果表明,与毕赤树干酵母不同,在重组酿酒酵母中木糖还原酶基因以组成型表达,而木糖醇脱氢酶基因在某种程序上受木糖的诱导.与毕赤树干酵母相比,重组酿酒酵母菌株中的木糖醇脱氢酶的比活力明显较低,这说明在Sc NLR04中该基因的表达存在某些抑制作用,这一缺陷可能是重组酵母菌株发酵木糖的瓶颈之一.     

利用油茶油体蛋白系统表达金属硫蛋白的载体构建

利用油体蛋白表达系统生产活性蛋白,是一种利用生物反应器生产高纯度无污染活性肽的新方法。为给后期油茶油体蛋白表达系统的开发应用提供依据,分别以油茶油体蛋白基因和油茶金属硫蛋白基因为模板设计引物,PCR扩增获得CDS片段,通过酶切连接构建p ET30a重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达,在此基础上将两者二次重组,成功构建油茶油体蛋白金属硫基因表达载体。     

响应面法优化毕赤酵母基因工程菌表达木聚糖酶条件研究

木聚糖酶作为降解木聚糖的关键酶之一,在制药、纸浆造纸和食品等领域有着广泛的应用。为了进一步提高重组毕赤酵母基因工程菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达产木聚糖酶的能力,采用响应面法对其发酵条件进行优化。先通过Plackett-Burman法筛选出3个对产酶有显著影响的重要因素,分别为初始pH、组氨酸添加量和甲醇添加量;再利用单因素法逼近最大响应区域,并结合Box-Behnken试验获得最优的发酵条件为初始pH 58、组氨酸添加量06%、甲醇添加量085%。在最优的发酵条件下,重组菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达木聚糖酶酶活达到3 604 U/mL,较未优化前提高了256倍,其3组平行试验值与模型的预测值基本相符,说明预测模型的可信度高,研究结果能为建立重组菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达木聚糖酶的制备工艺提供依据。     

催化槲皮素生成异鼠李素的重组菌构建及其转化条件优化

异鼠李素是一种黄酮类化合物,广泛存在于银杏、沙棘、旱柳和枸杞等植物中,具有多种药理作用。植物来源的O-甲基化酶能对槲皮素羟基进行甲基化,因而构建重组菌高效表达O-甲基化酶可应用于催化槲皮素生成异鼠李素。笔者对大豆来源的O-甲基化酶SOMT-9编码基因进行了密码子优化,其密码子适应指数(CAI)从优化前的0.59,提高为0.87。将优化后的基因SysOMT-9插入表达载体pGEX-2T,构建获得重组质粒pGEX-SysOMT。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过改变诱导温度及诱导剂浓度,实现了SOMT-9可溶性表达。在此基础上对其转化条件进行了优化,其最佳转化条件为:起始菌量OD600为10,转化温度为30℃,诱导剂IPTG用量为0.01mmol/L,助溶剂DMSO质量分数为1%,1%甘油,40μmol/L的S-腺苷基甲硫氨酸和1mmol/L槲皮素。在此条件下,重组菌在12h内,可将127mg/L的槲皮素,转化生成133mg/L异鼠李素,摩尔转化率为42%,是优化前的7.8倍。     

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。     

Intsia palembanica wood extracts and its isolated compounds as Propionibacterium acnes lipase inhibitor

Potential compounds from Intsia palembanica methanol extracts were isolated. Three isolated compounds as well as 7 reported compounds from Merbau were analyzed for their ability to inhibit the lipase activity of Propionibacterium acnes. Lipase was isolated from P. acnes and used as enzyme for activity analysis. The lipase activity test was performed using the 2,3-dimercapto-1-propanol tributyrate (BALB) method. The results showed that methanol extract and water fraction were active to inhibit lipase activity but n-hexane fraction and EtOAc fraction did not reach 50 % inhibition until 500 μg/ml. EtOAc fraction consisted of flavonoid, naringenin, robinetin, and (+)-epirobidanol accelerated the lipase activity. The other 7 compounds showed inhibitory activity of lipase in a concentration-dependent manner. In conclusion, fustin is the most active compound to inhibit the P. acnes lipase activity.     

逆境胁迫下柽柳脂质转运蛋白基因 (ThLTP)的克隆与功能初步分析

从以刚毛柽柳为材料构建的NaCl胁迫的根cDNA文库中测序得到1条LTP基因序列,其全长为635 bp、编码116个氨基酸,命名为ThLTP基因。采用实时荧光定量RT-PCR的方法,分别对0.2 mol.L-1NaCl、150μmol.L-1CdCl2、20%(W/V)PEG6000、100μmol.L-1ABA及4℃下ThLTP基因在柽柳中的表达模式进行了分析,结果表明:ThLTP基因除了在4℃条件下根组织中为下调表达外,在其它处理中均表现为上调表达。将ThLTP基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的原核表达载体pET32a中,对重组菌Escherichia coli BL21(pET32a-LTP)的抗旱耐盐性进行分析。结果表明:在0.8%(W/V)NaCl和20%(W/V)PEG6000条件下,对照菌E.coli BL21(pET32a)无对数生长期,而重组菌E.colii BL21(pET32a-LTP)经过3 h的延迟生长后,进入到对数增长期,表明ThLTP可受盐、碱、低温诱导并能提高重组菌的抗旱耐盐能力。     

来源于解酯菌的嗜热耐碱脂肪酶的表达纯化及其酶学性质研究

脂肪酶广泛应用于食品加工、生物柴油制备等领域。为了有效提高微生物脂肪酶的可利用度,将来源于解酯嗜热菌(Thermosyntropha lipolytica DSM 11003)的脂肪酶基因(tll2)克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a TLL2,将pET28a TLL2转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行高效表达。通过热处理和镍柱亲和层析得到电泳纯的蛋白TlLip2,对其进行酶学性质表征。结果显示,TlLip2的亚基分子质量为57 ku,比酶活为31 U/mg,最适反应pH及温度分别为8.0和60℃。在60℃以下、pH 6.0~11.0范围内,TlLip2的稳定性较好,相对酶活均维持在60%以上。金属离子K+和Na+对TlLip2有较大激活作用,而Co^2+、Zn^2+、SDS和Tween 80对TlLip2酶活力抑制作用明显。TlLip2在极性小的有机溶剂中具有较好的耐受性。TlLip2对中等碳链长度的对硝基苯酯显示出更高的活性,其中以对硝基苯己酯为底物时,TlLip2的酶活最高;以对硝基苯棕榈酸酯为底物时,该酶的动力学常数Km为0.29 mmol/L,Vmax为2.28 mmol/(L·min^-1),kcat为6.19 s^-1。此外,将其应用到油酸乙酯的合成研究中,以油酸和乙醇为底物,研究TlLip2催化制备油酸乙酯的转化条件,结果表明在60℃、加酶量为100 U/g的TlLip2,催化摩尔比为1∶2的油酸和乙醇,12 h后油酸乙酯的转化率达到62.1%,表明TlLip2在催化脂肪酸酯化方面具有较大的应用潜能。     

Cloning and expression analysis of the FvNCED3 gene and its promoter from ash(Fraxinus velutina)

The 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)gene is rate-limiting in abscisic acid(ABA) biosynthesis.In this study, an NCED gene, designated FvNCED3(KY008746), was cloned from velvet ash(Fraxinus velutina Torr.) with a RACE method. The full length c DNA of FvNCED3 encodes a 573-amino acid polypeptide.Sequencing analysis showed that the FvNCED3 protein was highly homologous to other NCED proteins. The expression patterns of FvNCED3 in different ash organs were analyzed by real-time PCR which revealed that FvNCED3 expression levels were highest in leaves and lowest in roots. The gene expression patterns of FvNCED3 under abiotic stress indicated that its expression increased under drought, salt and ABA stress and decreased due to high and low temperatures. There were no obvious changes under ultraviolet light. The 1094-bp upstream sequence 5' flank regulation region of the FvNCED3 gene was also cloned from ash using the Genome Walking method. To assess the activity of the FvNCED3 promoter, a p FvNCED3 p::GUS plant expression vector was constructed for tobacco transformation. GUS expression of the FvNCED3 GUS enzyme activity was detected in almost all transgenic tobacco tissues, especially in the young leaves,stigma, anther, ovule and ovary. After treating the transgenic tobacco with NaCl and placing it under drought stress, GUS staining of tobacco leaves increased compared with that under normal growth conditions. This result indicates that gene expression driven by the FvNCED3 promoter can be induced by salt and drought stress.     

AAT基因转化杂交构树叶片组培筛选研究

为了提高杂交构树的组培效率,以蒺藜苜蓿为研究对象,进行生物信息分析,克隆蒺藜苜蓿目的基因AAT,构建表达载体,通过农杆菌转化方法将目的载体转入杂交构树组培叶片中,优化组培相关体系配比,抗生素筛选配比,RT-PCR和定量PCR检验重组植株。结果表明:最佳灭菌体系为75%乙醇消毒20 s,0.3%HgCl 2消毒15 min,污染率低,成活率高;最佳愈伤期激素配比为6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L,最佳壮苗期激素配比为6-BA 1.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L。最佳筛选抗生素配比为噻孢霉素(Cef)300 mg/L、潮霉素(Hyg)7.5 mg/L;通过RT-PCR验证试验结果,并通过定量PCR测定AAT基因表达含量,重组植株与野生型相比提高2.5倍。试验首次建立了重组载体遗传转化杂交构树,对叶片组培及筛选方法具有重要意义。     

杨树皮储藏蛋白基因启动子的克隆和功能研究

杨树树皮储藏蛋白BSP是类似种子储藏蛋白的氮素储藏物 ,冬季在韧皮部薄壁细胞中大量积累 ,是落叶树氮代谢中的重要成分。为了研究BSP基因启动子在转基因植物中的表达特性 ,探索其在植物基因工程研究中潜在的应用价值 ,我们用PCR方法从美洲黑杨基因组中DNA扩增得到了BSA启动子片段。与GUS基因融合构建中间载体后 ,转化烟草 ,获得了一批PCR检测为阳性的转化再生植株。经GUS组织化学检测 ,发现若干转基因烟草的茎和叶柄韧皮部以及叶脉都呈GUS染色阳性 ,初步证明杨树BSP基因启动子确有韧皮部表达特性 ,可介导GUS基因在转基因烟草韧皮部特异表达。     

麻疯树pepc基因正义、反义植物表达载体构建与功能初步分析

根据麻疯树pepc基因和植物表达载体的酶切位点特征,分别将pepc基因全长序列3 000 bp正向插入pCAMBIA2300,构建了正义表达载体pCAMBIA-Jcpepc,基因片段597 bp反向插入pBI121构建了反义表达载体pBIJcpepc.通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,通过对转基因植株的PCR和PCR...