3种细胞培养流感病毒的比较

将流感病毒分别接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)、Vero和MDCK细胞,并改变细胞维持液中FBS浓度,然后检测胰酶的用量、细胞培养流感病毒的最佳时间、细胞接种病毒最佳吸附时间和接种剂量、收获细胞液后的血凝素(HA)滴度.结果表明,胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用;加入约4 μg/mL的胰酶可提高病毒产量.最佳收获时间为60 h～72 h,吸附时间为90 min,接种剂量为0.1 mL/L;CEF、MDCK细胞上病毒HA滴度高于Vero细胞.     

金银花、山银花黄酮类提取物体外抗伪狂犬病病毒作用研究

分别提取湖南金银花和山银花黄酮类活性成分,利用Vero细胞体外培养系统,通过观察细胞病变效应（CPE）来评价中药金银花和山银花黄酮类提取物体外抑制伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）对细胞的感染作用,并通过MTT法检测细胞活性。研究比较金银花、山银花的抗病毒作用,初步探讨中药抗病毒机制。结果表明：在安全浓度范围内,金银花和山银花黄酮类提取物均具有显著的抗病毒作用,体外对PRV分别具有明显的阻断、抑制和中和作用,其中山银花对PRV体外的抑制作用强于金银花,而阻断作用和中和作用,两者差异不显著。     

Vero细胞两阶段扩大培养工艺研究

两阶段珠到珠转移方法（包含最初8h的间歇搅拌和接下来的连续搅拌阶段）可以实现Vero细胞的扩大培养，按照新老载体2：1的比例放大，载体空载率能从最初的66．7％降到3．5～6．3％。在间歇搅拌阶段，转速对新载体建桥率没有显著影响，但在连续搅拌阶段，60r／min转速仅能使载体空载率降低到28．9％，甚至比35r／min连续搅拌产生的空载率还高8％。在新老载体1：1放大过程中，5eg／mL的胰酶不能促进细胞在载体Cytodex-3间的转移，最后的载体空载率仍高达10．8％。这些研究结果为Vero细胞通过珠到珠转移方式在其他系统或以更大扩增倍数进行的放大培养过程提供了重要信息。     

南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时对胞外产物的细胞毒性和其致病性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,但不具有淀粉酶和卵磷脂酶活性,具有很强的溶血活性和细胞毒性。肌肉注射感染发现,其对南方鲇有强致病性,其LD50为每千克鱼体重0.802 mg;注射后的南方鲇肌肉、心、肝、肾、脾、肠和胃等组织发生了严重组织病理变化,骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质内大量炎症细胞浸润;脾充血、出血,淋巴细胞减少,胃肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落。     

NDⅠ系Vero细胞苗对雏鸡的实验性免疫研究

选用了鸡新城疫(ND)Ⅰ系 Vero 细胞苗,用于非免疫10d 龄雏和25d 龄雏。结果显示,Vero细胞苗对10d 龄雏是不安全的,危险的。但对25d 龄雏则是安全的。Vero 细胞苗对具有母源抗体的18d 龄和33d 龄雏的免疫接种证明是安全的、有效的,其免疫期持续达6个月,仍可保护雏鸡耐受鸡新城疫病毒(NDV)强毒株的攻击。这一实验表明,对有母源抗体的雏鸡早期应用 Vero 细胞苗可以大大地简化免疫程序,即雏鸡首免后,可延长到开产。再进行加强免疫。     

H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的克隆与表达

应用RT-PCR方法扩增了1株H1N1亚型猪流感病毒的血凝素基因,并克隆到pMD 18-T Simple载体中,经PCR、酶切和测序验证克隆正确后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建了重组质粒pcDNA-HA。在脂质体作用下重组质粒pcDNA-HA转染Vero细胞。间接免疫荧光试验结果表明,血凝素基因在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,这为猪流感病毒DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白在Vero细胞的表达与分布

将传染性支气管炎病毒（IBV）ZJ971 S1基因亚克隆到绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP—C2中，成功构建重组表达质粒pEGFP—ZJ971-S1。重组质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞，借助荧光显微镜在转染后4h观察到S1—GFP融合蛋白的瞬时表达。免疫细胞化学染色（ICC）结果显示，抗ZJ971 S1D蛋白单克隆抗体和鸡抗IBVZJ971全病毒血清特异性识别了S1基因转染细胞，表明S1蛋白在Vero细胞中得到有效表达。荧光显微镜观察和ICC均表明，S1表达蛋白主要分布在转染细胞的胞浆内，而胞核中未见分布，提示IBVS1蛋白内可能存在与病毒装配相关的细胞定位信号。     

金银花、山银花绿原酸类提取物体外抗NDV作用研究

为研究比较价格差异较大的金银花和山银花的体外抗病毒作用,分别提取金银花和山银花绿原酸类活性成分,利用Vero细胞体外培养系统,通过观察细胞病变效应（CPE）,并用MTT法检测细胞活性来评价和比较金银花和山银花绿原酸类提取物体外抑制新城疫病毒（NDV）对细胞的感染作用。结果表明：在安全浓度范围内,金银花和山银花绿原酸类提取物均具有显著的抗病毒作用,体外对NDV分别具有明显的阻断作用、抑制作用和中和作用,且两者之间的抗病毒效果差异不显著。本试验为价格相对便宜的山银花在一定领域部分代替金银花提供了实验依据。     

串联型黄色荧光蛋白在Vero细胞中的表达

试验旨在探索串联型黄色荧光蛋白(YFP)在真核细胞中的表达,以便于构建用于球虫转基因研究的载体.用PCR方法克隆了不含鼠鸟氨酸脱羧酶PEST序列的目的DNA片段YFP-1和YFP-2,并将其依次连接于原始载体pd2EYFP-N1以替换d2EYFP报告基因,将重组载体电转染Vero细胞,观察荧光情况.结果显示,重组载体pYFP-YFP-N1能够在Vero细胞中正常表达,串联型YFP基因可用于球虫转基因中载体构建.     

Isolation and molecular characterisation of Neospora caninum in cattle in New Zealand

AIM: To isolate Neospora caninum from the brains of naturally infected cattle and use molecular techniques to characterise the isolates.

METHODS: Neospora caninum tachyzoites were isolated in Vero cell culture from the brains of a cow and two calves. The isolates were characterised using polymerase chain reaction (PCR) methods, DNA sequencing, an immunofluorescent anti-body test (IFAT), transmission electron microscopy (TEM), and immunohistochemistry (IHC). The brains of the three cattle were subjected to histopathological examination. A pathogenicity study was conducted in 120 BALB/c mice.

RESULTS: Neospora caninum tachyzoites were isolated from all three cases and first observed in vitro between 14 and 17 days post-inoculation. Parasites were sub-cultured and maintained in Vero cell culture for more than 6 months. PCR products were generated for all three isolates, using two different primers. Sequencing of the PCR products and a subsequent BLAST search identified the isolates as N. caninum. In addition, the isolates tested positive using IFAT and IHC, and ultrastructure revealed by TEM was characteristic of N. caninum. Histopathological examination revealed lesions characteristic of N. caninum in 1/3 brains. In the pathogenicity study using BALB/c mice, the mortality rate was 3–7%.

CONCLUSION: This was the first successful isolation of N. caninum in New Zealand confirmed using molecular characterisation tests.