广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。     

柑橘黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实品质的影响

为了定量衡量黄龙病菌量对琼中绿橙果实品质的影响，本实验以采自海南琼中橘园中感染了柑橘黄龙病的琼中绿橙为实验材料，用实时荧光定量PCR相对定量的方法测定果实中柑橘黄龙病菌的浓度，同时对果实品质的8个外在指标（果实纵经、横径、果形指数、单果重、果皮率、残渣率、种子数量、种子重量）和5个内在指标（果汁率、可食率、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比）进行测定，研究黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实品质的影响。结果表明：随着琼中绿橙果实中柑橘黄龙病菌浓度的增大，果实外观品质变化明显的指标包括果实纵经、果形指数、单果重（p<0.05），其中果实纵经呈现明显下降趋势，从64.97mm下降到57.44mm，相对较少11.59%；果形指数呈现明显上升趋势，从0.83上升到0.94，相对增多13.25%；单果重呈现下降趋势，从166.35g下降到109.66g，相对较少34.08%；果实横径、果皮率、残渣率、种子数量、种子重量等指标变化不明显。随着琼中绿橙果实中柑橘黄龙病菌浓度的增大，果实内在品质变化明显的指标为可溶性固形物含量，可溶性固形物含量呈现明显下降趋势（P<0.05），从9.65%下降到8.19%，相对减少15.13%；果汁率、可食率、可滴定酸含量和TSS/TA没有明显变化。结论：在黄龙病菌浓度增加的情况下，琼中绿橙在果实外观、内在品质等多个指标呈现下降趋势。研究结果为定量评价黄龙病对柑橘果实的影响提供参考。     

Decreasing detection frequency of MITE(MCLas-A) in the population of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' recently collected in southern China

An active miniature inverted-repeat transposable element(MITE), MCLas-A, was previously identified from ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' known to be associated with citrus Huanglongbing(HLB, yellow shoot disease). To explore the recent transposition status of MCLas-A, 389 ‘Ca. L. asiaticus' strains collected from nine regions in China were amplified using a specific primer set and three representative ‘Ca. L. asiaticus' strains were analyzed by next-generation sequencing(NGS) approach. PCR and genomic analysis showed that the entire MCLas-A was only present in 1.80%(7/389) and the jumping-out type of the MITE was predominant(81.23%) in samples tested, suggesting high frequency transposition occurred in ‘Ca. L. asiaticus' strains recently collected from China. Biological roles of transposition of the active MITE remain to be determined.     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

沙田柚黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析

采集田间表现斑驳症状的沙田柚叶脉,用CTAB法提取总DNA。根据柑橘黄龙病病原16S rDNA的核苷酸序列设计引物P1/P2,进行PCR扩增,获得1条大小为1 167 bp的片段。酶切分析显示,该片段可被切成大小分别约为640 bp和520 bp的2个片段。扩增产物经纯化,与pM D 18-T V ector连接,转化大肠杆菌(E scherich ia coli)DH 5α,筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析,结果表明,与柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA的同源性为99%,与非洲种的同源性为97%,与美洲种的同源性为96%。认为,沙田柚的斑驳症状是由黄龙病病原引致的,称之为沙田柚黄龙病。该沙田柚黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种(L iberobacter as iaticus)中的一个成员。系统进化树分析显示,沙田柚黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近,推测是直接来自中国柑橘黄龙病病原。     

斑驳型黄龙病对砂糖橘产量和品质的影响

本文对斑驳型黄龙病不同发病程度的砂糖橘植株制订系统明确的严重度分级标准，将不同严重度的6年生砂糖橘植株进行单株产量的测定，0~4级株产量分别为61.9±4.08 kg、29.75±3.57 kg、19.43±1.36 kg、14.08±1.11 kg和9.7±0.80 kg。不同严重度的砂糖橘单株产量呈显著差异(P<0.05)，严重度越高，单株产量越低。另外，对显症砂糖橘果实（红鼻子果）和健康砂糖橘进行单果称重、可溶性固形物和维生素C含量测定，红鼻子果的含量比健康果实的含量呈极显著降低(P<0.01)。     

基于羧基化石墨烯-海藻酸钠复合材料的脱落酸电化学免疫传感器的构建及应用

脱落酸(Abscisic Acid,ABA)是一种重要的植物激素,在种子和芽休眠、器官大小控制、植物衰老和死亡等发育过程中发挥作用,同时调控植物的生物与非生物胁迫.为快速、准确地测定植物体内ABA的含量,本研究开发了一种新型的ABA免疫传感器.通过在电极表面修饰羧基化石墨烯(GR-COOH)及海藻酸钠(Sodium A...     

土霉素对柑橘黄龙病的防治效果及对柑橘产量和品质的影响

为有效防控柑橘黄龙病，于2017年在佛罗里达大学柑橘研究与教育中心的奥本代尔市柑橘试验场进行田间试验筛选黄龙病的防治药剂及其浓度，测定注射土霉素后叶片中柑橘黄龙病菌亚洲种Cadidatus Liberibacter asiaticus、土霉素、淀粉含量、柑橘产量、出汁率、可溶性固形物含量和酸度，显微镜下观察注射土霉素后淀粉粒的分布。结果表明，浓度为1.6g/株土霉素处理180 d后柑橘叶片中黄龙病菌亚洲种含量减少幅度最大，为91.78%；注射浓度为1.6g/株土霉素后7d，叶片中土霉素含量达142.2 μg/kg，注射后11 d叶片中土霉素含量达到最大，为239.8 μg/kg，注射后45 d叶片中土霉素含量低至99.6 μg/kg以下；注射后7~90d，叶片中黄龙病菌亚洲种含量呈波浪形变化，注射90 d后叶片中黄龙病菌亚洲种含量一直处于增长趋势，叶片中黄龙病菌亚洲种含量总体随着土霉素含量的升高而降低；注射浓度为1.6g/株土霉素后，叶片中淀粉含量大幅度下降，60d时达到最低值，为3.3 μg/mm²，90d时达到峰值，为14.5 μg/mm²；单株产量为16.7 kg，与注射浓度为0.8 g/株土霉素处理差异不显著，但均显著高于其它2个处理；柑橘出汁率、可溶性固形物和酸度均与清水对照差异不显著。表明土霉素可有效抑制黄龙病菌亚洲种，减少柑橘叶片内淀粉含量，增加柑橘产量，但对果实品质未产生显著影响。     

基于日光诱导叶绿素荧光的柑橘黄龙病原位诊断

柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）是柑橘生产中的毁灭性病害,柑橘植株遭到黄龙病菌侵染后光合能力发生变化而后表现出相应的黄化症状。及早实现HLB的原位快速诊断是防控HLB的重要手段。为探究黄龙病菌侵染柑橘叶片的光合响应机制并实现HLB的原位诊断,该研究分析了健康（Healthy）、未显症HLB（asymptomatic HLB, aHLB）、显症HLB（symptomatic HLB, sHLB）以及黄斑病（Macular,症状与黄龙病相似）柑橘叶片的光合参数与光合色素含量差异。利用光谱技术与日光诱导叶绿素荧光（Sun-induced Chlorophyll Fluorescence, SIF）技术分析了4种类型柑橘叶片的反射率光谱与SIF光谱差异。采用竞争自适应重加权采样（Competitive Adaptive Reweighted Sampling, CARS）算法结合反射率光谱筛选出特征波段,采用SIF光谱的峰值位置（687和741 nm）构建了上行（Upward, Up）和下行（Downward, Dw）SIF产量指数（Up687, Up741, Dw687, Dw741, Up687/741, Dw687/741）。进一步分别利用特征波段的反射率和SIF产量指数,结合K最邻近（K-nearest Neighbor, KNN）分类算法构建了柑橘黄龙病的诊断模型。结果表明,黄龙病菌的侵染使柑橘叶片的光合作用明显减弱,在未显症时期已经表现出来,证明了SIF技术在诊断早期HLB的优势。基于特征波段反射率的KNN模型对未显症HLB和显症HLB的诊断精度为72.7%和75.6%,健康叶片和黄斑病叶片分别为82.2%和64.1%,而基于687和741 nm波长处的上行比值SIF产量指数Up687/741构建的KNN模型对未显症HLB和显症HLB的诊断精度为84.8%和91.1%,健康和黄斑病叶片分别为88.9%和82.1%,均优于反射率光谱模型。结果证明了SIF技术用于诊断柑橘HLB的潜力,为实现柑橘HLB的田间原位、快速、早期诊断提供了可能。