甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

硅藻土吸附固定化Bacillus sp.DL-2胞内蛋白酶拆分制备(S)-乙酸苏合香酯

[目的](S)-乙酸苏合香酯是手性药物合成的关键手性砌块,其在多种手性化合物的合成及医药、香料的工业生产中具有重要的作用.传统的化学合成手性化合物的方法需要有毒有机溶剂及重金属的参与,对环境及人类具有严重的危害,同时得到的手性化合物的光学纯度较低.与传统的化学合成相比,酶法选择性拆分消旋体化合物,具有高立体专一性和区域选择性、副反应少、产率高、产物光学纯度好以及反应条件温和的优点,是一种被广泛认可的拆分方法.实验表明,Bacillus sp.DL-2胞内蛋白游离酶可拆分制备(S)-乙酸苏合香酯,然而游离酶不易回收且稳定性差,将Bacillus sp.DL-2胞内蛋白游离酶制备成固定化制剂,克服了游离酶对环境敏感,稳定性不高的缺点,为工业化生产(S)-乙酸苏合香酯奠定了基础.[方法]酶的固定化方法主要有物理吸附法、离子结合法、共价结合法、交联法和包埋法.以吸附法固定酶,酶的构象很少改变,因此,酶的催化活力损失较少;且吸附法固定化操作过程简单,因此吸附法在经济上是最具吸引力的固定化方法.硅藻土由硅藻的细胞壁沉积而成,硅藻土表面的多孔性与负电性使其呈现明显表面吸附性,因而被常用做吸附载体.以硅藻土作为固定化载体,对Bacillus sp.DL-2胞内蛋白酶进行固定化,用以拆分制备高光学纯的(S)-乙酸苏合香酯.利用单因素实验优化,确定制备固定化酶的最佳固定化条件及制备(S)-乙酸苏合香酯的最佳拆分条件,并测定了制备的固定化酶对金属离子的敏感度及储存稳定性.[结果]最佳固定化条件为:温度40℃,pH为7,固定化时间10 h,载体添加量100 g/L.在最佳固定化条件下制备了固定化酶,优化确定了制备(S)-乙酸苏合香酯的最佳拆分条件为:固定化酶用量为160 mg/mL,拆分时间7 h,拆分温度30℃,缓冲液pH为7.[结论]在最佳固定化及拆分条件下,制备的(S)-乙酸苏合香酯e.e.值可达到96.8％,转化率为73.9％,且固定化酶对金属离子敏感度较低,对反应环境要求较低,适用于工业化生产.固定化酶在4℃条件下储存,随保存周数的增加,e.e.值及转化率均逐渐降低,但4周后e.e.值仍能达到90.1％,转化率保持在66.6％左右,具备较高的储存稳定性,为工业化生产(S)-乙酸苏合香酯提供了参考.     

内蒙古草原家庭牧场可持续发展研究

内蒙古草原作为全球干旱、半干旱区的重要组成部分，是诸多研究关注的热点区域。家庭牧场作为内蒙古草原基本的生产和管理单元，探析其可持续发展有助于为实现区域可持续发展提供科学依据。本研究阐述了内蒙古草原家庭牧场的形成历程及定义；并分别侧重自然生态系统、社会经济系统、自然-经济-社会复合生态系统3个方面总结了其研究进展；最后分别在坚持草牧业发展理念、依托景观可持续性科学指导、加强3个界面耦合研究、扩展沙地草原、关注未来发展模式、重视技术支撑等6个方面就内蒙古草原家庭牧场进行了研究展望。希望本研究在为内蒙古草原可持续发展提供科学支撑的同时，亦能为全球干旱、半干旱草原区的可持续发展提供参考。     

黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

膜联蛋白B1在猪囊尾蚴免疫逃避作用的研究进展

膜联蛋白是一类有效的内源性调节蛋白,在Ca²⁺存在的条件下与膜磷脂结合,参与细胞活动的多种功能,其与肿瘤发生、自身免疫性疾病、病毒和寄生虫感染等密切相关。作为膜联蛋白家族成员Annexin B1具有独特的氨基酸残基结构,与不同种属的寄生虫入侵特异性宿主密切相关。本文主要阐述了膜联蛋白的种类及膜联蛋白B1在猪囊尾蚴感染宿主机体过程中免疫逃避的作用,旨在探索其猪囊尾蚴感染的免疫逃避机制。深入对膜联蛋白B1和囊尾蚴之间相互关系的进一步了解,以及膜联蛋白B1在寄生虫免疫中更深入的研究,对寄生虫免疫逃避的生物学意义和寄生虫病诊断治疗提供了相关的策略。     

杉木第3代种子园多元素配方施肥效应研究

杉木种子园为培育高产稳产杉木良种提供重要保障,在林业生产中具有积极意义。通过试验研究,探究杉木3代种子园土壤养分丰缺情况、养分间的平衡规律,确定杉木种子园最佳肥料配比和施肥量,以期为闽北低山丘陵红壤分布区杉木种子园提供推荐施肥配方。采用“3414”配方施肥设计方案,对闽北第3代杉木种子园开展N、P、K、Ca、Mg、B、Mo等元素施肥试验。分别设计大量元素氮、磷、钾三因素施肥水平（并增设施用钼肥处理）、中微量元素钙、镁、硼三因素施肥水平,以球果数量（质量）、出籽率、种子产量、胸径等为评价指标,拟合肥料效应函数方程,研究各养分间的作用规律,并提出最佳施肥配比和施肥量。结果表明：种子园土壤N、P、K、Ca、Mg养分含量较低,B含量属于中等水平,而Mo含量较高;N、P、Mg以及N-K、Ca-B肥料联合对种子园产量的影响达到显著或极显著水平,而单施某一肥料效应较小,其中单施K、Ca、B几乎没有效果,而肥料联合施用效果较好。综合效应分析结果,得出种子园最大产量施肥量组合为：每株施尿素100 g+过磷酸钙897 g+氯化钾150 g+石灰150 g+硫酸镁105 g+硼砂75 g,并配施钼肥。N、P₂O₅、K₂O、CaO、Mg、B、Mo的用量依次为46.0、107.7、90.0、75.0、31.4、2.3、5.0 g,其配比为N:P₂O₅:K₂O:CaO:Mg:B:Mo=1.0:2.3:2.0:1.6:0.7:0.05:0.1。多元素配方施肥能很好地改善杉木种子园产量和质量,单株球果产量、球果单粒重、出籽率及种子园产量等指标均比不施肥的母树有大幅度提高。本研究施肥方案,理论上种子园产量可达45.99~95.65 g/株,大量元素施肥试验的产量达到理论产量的80%~86%,中微量元素施肥试验的产量为理论产量的70%左右。现实种子园平均产量大约是预测产量的40%,通过合理配方施肥有望大幅度提高杉木3代种子园产量。     

无机盐种类与用量对AMEP蛋白表达水平的影响

AMEP蛋白是从枯草芽孢杆菌中分离鉴定出来的一种新型蛋白激发子,能够诱导植物防卫反应并提高植物的抗病性,是生物农药的理想候选.在前期的研究中发现,培养基中的无机盐对AMEP蛋白表达水平有很大影响.为了最大限度地提高AMEP蛋白的产量,通过在AMEP蛋白的发酵培养基中添加多种无机盐,研究不同种类的无机盐对AMEP蛋白表达水平的影响.结果表明,磷酸钙和磷酸氢二钠能显著提高AMEP蛋白的表达水平,而氯化钠、氯化钙、硫酸锌则显著降低了AMEP蛋白的表达水平.当磷酸钙用量为2g/L时,AMEP蛋白表达产量最高.     

过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。