黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系，以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP 为载体，农杆菌LBA4404为介体，对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢 子浓度106个/mL，农杆菌OD600值0.6，乙酰丁香酮浓度200 μmol/mL，pH 5.8，25℃，共培养4 d，获得120～161个转化 子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传，绿色荧光蛋白基因gfp 表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。 PCR鉴定发现T-DNA 已整合进油菜黑胫病菌基因组中，Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病 菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了 基础。     

油菜核盘菌对戊唑醇的敏感性及室内抗药性诱导

为了探明油菜核盘菌对戊唑醇的敏感性，对68株油菜核盘菌的戊唑醇室内敏感性进行了试验。同时通     

甘蓝型油菜BnNAC61 基因的克隆及表达特征分析

NAC(即NAM、ATAF和CUC)转录因子参与植物生长、发育、衰老和多种逆境胁迫反应的调控。为阐释甘蓝型油菜BnNAC61的表达特征,本研究采用RT-PCR方法,从甘蓝型油菜总cDNA中克隆BnNAC61基因。生物信息学分析表明,其CDS全长846 bp,编码281个氨基酸,N端含有NAM保守结构域;其启动子区存在W-box、响应抗性和胁迫、ABA、MeJA的顺式作用元件。利用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位,结果发现BnNAC61定位在细胞核。酵母试验表明,BnNAC61属于转录激活子,转录激活区位于136～208 aa区段。利用qRT-PCR研究BnNAC61的表达模式,结果表明,黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)接种处理后,BnNAC61被显著诱导上调表达;逆境胁迫PEG、NaCl、4℃处理后BnNAC61被不同程度地诱导表达,表现先升高后降低的趋势;激素SA、MeJA和ACC处理后BnNAC61表达量显著高于对照(P0.05),而激素ABA处理后,BnNAC61表达被抑制。上述结果表明BnNAC61是参与多种逆境胁迫的转录因子,尤其可能在茉莉酸和乙烯信号途径中发挥重要作用。     

油菜黑胫病抗性相关基因BnWRKY70的功能研究

WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp特异区段,利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）载体构建了基于病毒诱导的油菜基因沉默体系;利用qRT-PCR验证目的基因的表达水平;最后进一步通过表型观察和病情指数统计分析评价BnWRKY70基因沉默植株在接种黑胫病菌之后油菜的抗病性。结果表明,BnWRKY70基因最长ORF为858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子。BnWRKY70基因沉默后的表达量显著下降,说明在油菜中成功构建了VIGS体系。表型观察发现基因沉默油菜株系叶片比未沉默株系更易感病,病斑面积更大,且病情指数显著高于对照,说明BnWRKY70基因沉默减弱了油菜的抗病性。本研究为揭示BnWRKY70在油菜病原菌分子互作机制中的作用奠定基础。