玉米ZmSNAC13等位变异对抗旱性的调控研究

NAC家族转录因子是植物特有的,在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要的生物学功能。前期根据干旱胁迫处理RNA-Seq筛选到NAC转录因子基因ZmSNAC13。为了探究ZmSNAC13在干旱胁迫响应中的作用,以耐旱性不同的玉米自交系B73（干旱敏感）和Qi319（耐旱）为材料,进行荧光定量PCR分析,发现干旱处理后ZmSNAC13在2个材料根中均下调表达,干旱处理12 d后在茎中均上调表达,Qi319干旱处理12 d后在叶中上调表达,而B73干旱处理8和10 d后在叶中下调表达,表明ZmSNAC13基因响应干旱胁迫。利用双荧光素酶融合报告载体分析ABA处理对ZmSNAC13基因启动子活性的影响,结果表明,ABA处理下Qi319的ZmSNAC13启动子活性显著高于B73,在Qi319的ZmSNAC13基因5’-UTR区发现9个能够提高启动子活性的高度连锁变异,并且干旱处理12 d时, Qi319叶中ZmSNAC13的表达量高于B73,因此推测干旱胁迫下ZmSNAC13基因5’-UTR区遗传等位变异通过影响启动子活性进而控制基因的表达水平,最终调控玉米对干旱胁迫的适应性。上述结果为解析玉米抗旱的遗传机制奠定了基础。     

甘薯丝裂原活化蛋白激酶MPK6对低温胁迫的响应

【目的】研究甘薯丝裂原活化蛋白激酶MPK6在抵御低温胁迫过程中的功能,为解析甘薯耐低温机制和遗传改良提供参考。【方法】采用农杆菌介导法,将35S::IbMPK6-GFP重组表达载体和对照载体质粒pDMC83转化甘薯愈伤组织,根据载体上特有的GFP序列设计引物对甘薯拟转基因材料进行分子鉴定,并通过qRT-PCR筛选表达量高的转基因株系。对非转基因植株（WT）和转基因株系进行低温胁迫和恢复处理,观察处理后及恢复后的表型变化;检测叶绿素荧光参数Fv/Fm、丙二醛（MDA）含量和过氧化氢（H₂O₂）含量等生理指标;利用二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色法观察活性氧的积累情况;分析低温信号转导途径中关键转录因子基因IbCBF3和下游基因IbCOR27的表达水平。【结果】共获得12株IbMPK6过表达甘薯株系,筛选IbMPK6表达量最高的3个过表达株系（L3、L8和L11）用作低温胁迫分析材料。低温胁迫下WT的Fv/Fm为0.50,而转基因株系L3、L8和L11的Fv/Fm分别为0.79、0.79和0.80,与WT呈现极显著差异水平。温度恢复后,转基因植株中Fv/Fm恢复至低温处理前水平,而WT中Fv/Fm仅为0.70,极显著低于转基因植株。低温胁迫下,WT的丙二醛含量为0.05 μmol·g^-1,而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分别为0.02、0.04和0.02 μmol·g ^-1,显著低于WT。温度恢复正常后,WT中的丙二醛含量为0.03 μmol·g ^-1,而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均为0.01 μmol·g ^-1。DAB和NBT染色结果显示,低温胁迫下,WT叶片与转基因株系叶片相比,染色较深,说明WT比转基因植株积累了更多的过氧化氢和超氧阴离子。过氧化氢含量测定结果显示,低温胁迫下和温度恢复后,转基因植株中过氧化氢的含量均显著低于WT。qRT-PCR结果表明IbCBF3和IbCOR27受低温诱导表达,且在WT和转基因株系之间差异显著。【结论】过表达IbMPK6甘薯植株通过缓解光合系统和膜系统的损伤、减少活性氧的积累,提高了对低温胁迫的耐受性。IbMPK6通过调控低温通路中相关基因IbCBF3和IbCOR27的表达,参与甘薯低温信号转导途径。     

胡杨PeREM6.5调控拟南芥水分胁迫耐受机制

  目的  Remorin蛋白是广泛存在于苔藓、裸子和被子植物中的蛋白家族,在调控植物生长发育及生物胁迫反应方面具有重要作用,但有关remorin抵御非生物胁迫作用机制的研究较少。前期研究发现抗逆树种胡杨的remorin 6.5（REM6.5）可通过增强质膜质子泵活性提高植物耐盐性,在此基础上,本文研究了胡杨PeREM6.5在植物耐受水分胁迫中的作用,旨在进一步揭示植物抗旱的生理与分子机制。  方法  以过表达PeREM6.5拟南芥（OE1和OE2）、野生型（WT）和转空载体对照（VC）拟南芥为试验材料,对各基因型拟南芥进行水分胁迫处理（包括渗透胁迫和土壤干旱）以及复水处理,从生理生化及分子生物学角度研究了胡杨PeREM6.5在拟南芥干旱胁迫中的响应机制。  结果  甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥的存活率、根长显著高于WT和VC,并且在渗透胁迫下细胞膜受损程度较小,这些表型差异主要与转基因拟南芥水分吸收、抗氧化防御能力增强有关。甘露醇处理后,过表达PeREM6.5拟南芥水通道基因AtPIP1;2和AtPIP2;1的表达量提高。甘露醇处理诱导WT和VC根细胞积累H₂O₂,对细胞膜造成氧化伤害。转基因株系在甘露醇处理后过氧化物酶基因POD和过氧化氢酶基因CAT表达量显著上调,能维持较高的POD和CAT酶活性,清除H₂O₂及其对细胞膜造成的损伤。在土壤干旱处理9 d后,转基因株系的叶绿素含量下降幅度低于WT和VC,复水后叶绿素含量恢复程度较高。另外,PeREM6.5转基因株系在干旱胁迫下维持PSⅡ实际光合量子产量的能力增强。  结论  过表达胡杨PeREM6.5基因提高了拟南芥对水分胁迫的耐受性。      

抗旱相关基因及其遗传工程

干旱是影响全球生态的重要因子,文章综述了转录调控因子和转录后RNA/蛋白修饰因子两类抗旱相关基因及其在耐旱性遗传改良中的应用。其中,胁迫应答的转录调控因子包括脱水响应因子(DRE)、锌指蛋白(ZFP)、核因子(NF-Y)和WRKY转录因子;转录后RNA/蛋白修饰因子包括蛋白的法尼基化、蛋白磷酸化和蛋白的聚ADP核糖基化作用。这些基因中有的已克隆并通过生物技术手段转入作物中,靶基因的表达提高了作物的抗旱性及产量。     

陆地棉GhWRKY33的克隆及抗旱功能分析

【目的】 通过克隆陆地棉GhWRKY33并研究其抗旱功能,为棉花抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】 利用同源克隆的方法从陆地棉中棉所10号中克隆GhWRKY33的开放读码框（open reading frame,ORF）,并进行生物信息学分析,分析该基因的二级结构、亲疏水性,预测磷酸化位点和启动子区域的顺式作用元件,在NCBI中通过BLASTP检索同源性高的蛋白序列进行序列比对并构建系统发育树;构建35S::GhWRKY33-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导注射烟草叶片,观察荧光信号;利用qRT-PCR检测基因的组织表达特异性,以及干旱、ABA、JA、ET处理下的基因表达模式;构建GhWRKY33过表达载体并转化拟南芥,利用20% PEG6000对野生型和T₃代转基因拟南芥进行干旱处理,观察处理后野生型和转基因拟南芥的表型,并测定脯氨酸和丙二醛含量等生理生化指标,分析目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平。【结果】 从陆地棉品种中棉所10号克隆获得GhWRKY33的ORF全长为1 533 bp,编码一个含510个氨基酸残基的蛋白,含有2个WRKY保守结构域和2个C₂H₂型锌指结构,属于第Ⅰ类WRKY转录因子家族;二级结构预测其编码的蛋白主要由无规则卷曲构成,含有26个苏氨酸磷酸化位点,推测可能与磷酸化有密切的关系,亲疏水性预测表明该蛋白属于亲水性蛋白;系统发育树分析显示该蛋白与GrWRKY33同源性最高。亚细胞定位将GhWRKY33定位于细胞核。qRT-PCR显示该基因具有明显的组织表达特异性,在棉花顶芽的表达量最高;干旱、ABA、JA、ET处理后,基因的表达量明显上升。干旱胁迫后,与野生型相比,转基因拟南芥的抗旱性水平明显提高,植株萎蔫程度较轻,其脯氨酸含量显著升高,丙二醛含量显著降低,且目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平均明显提高,表明PEG诱导了该基因的表达,进而调控了干旱响应基因表达上调,使转基因拟南芥表现出对干旱胁迫的抗性。【结论】 GhWRKY33响应干旱胁迫,过表达后能明显提高转基因拟南芥的抗旱性。     

干旱胁迫下两个玉米自交系雄穗花器官分化期的转录组分析

【目的】 运用现代分子生物学及高通量测序技术,在全基因组水平鉴定耐旱相关的基因,研究玉米雄穗花器官分化期对干旱胁迫的响应机理, 为抗旱育种将提供新的理论基础。【方法】 以干旱胁迫15 d和正常浇水的耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63” 花器官分化期的雄穗进行Illumina HiSeq 2000高通量测序分析,将测序得到的Unigene与玉米参考基因组进行比对,利用 RPKM 来衡量样本间的基因表达丰度, 以|log₂foldchange|≥1,P<0.05,FDR≤0.001筛选出样本间的差异表达基因, 并通过 Gene Onto 1ogy (GO ) 数据库、 KEGG pathway 数据库对筛选出的差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】 与正常水分处理相比,耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”在干旱胁迫下分别有1 394个和1 300个显著差异表达基因,其中共有差异表达基因831个,包括上下调表达趋势是一致的822个基因和9个具有相反的表达模式基因。除这些基因外,各自分别还有563个和469个基因型特异的干旱响应基因,这些特异的干旱响应基因的G0 富集分析的条目并不完全相同,除共同富集在刺激响应,细胞壁改变外,耐旱自交“PHBA6”还富集在激素合成调控,机氮化合物代谢、蛋白结合上,特异的干旱响应基因的KEGG 显著性富集分析在2个自交系中也不完全相同,耐旱自交“PHBA6”还有部分差异基因富集在生物素代谢通路上,另外,筛选出耐旱自交“PHBA6”中在干旱胁迫下差异表达的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子。【结论】 胁迫相关基因的特异性响应可能是材料间耐旱性存在差异的主要原因,耐旱自交“PHBA6”中的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子基因在玉米耐旱育种中可能有重要的利用价值。     

玉米转录因子ZmEREB93负调控籽粒发育

【目的】玉米作为重要的粮、经、饲多用作物,其产量的稳定对经济发展和粮食安全意义重大。AP2/EREBP（APETALA2/ ethylene response element binding protein,AP2/EREBP）转录因子在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。前期研究发现,玉米ZmBES1/BZR1-5转录因子靶基因ZmEREB93可能参与调控种子大小。克隆ZmEREB93,并对其表达特性及功能进行分析,为深入解析其调控玉米籽粒发育的功能与机制奠定基础。【方法】从玉米自交系B73中克隆ZmEREB93的全长序列,对其基因序列和编码氨基酸序列特征进行生物信息学分析。随后,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析其组织表达模式,分别构建植物和酵母表达载体,进行亚细胞定位和转录激活活性分析。经农杆菌介导法将ZmEREB93转入拟南芥,对转基因株系的种子表型进行分析。最后,通过体外染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing,Chip-seq）和共表达分析筛选ZmEREB93可能调控的候选靶基因,并通过酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）验证。【结果】成功克隆获得ZmEREB93,序列分析结果表明,ZmEREB93无内含子,开放阅读框长618 bp,编码205个氨基酸,有一个高度保守的AP2结构域,属于AP2家族的ERF亚类。qRT-PCR结果表明,ZmEREB93在授粉后15和25 d的种子中表达量较高,其中,在25 d种子中表达量最高,约为15 d种子中表达量的11倍,在茎和根中有微量表达,在雄穗、花丝及苞叶中无表达。转录激活试验结果表明,ZmEREB93蛋白在酵母细胞中不具有转录激活活性。亚细胞定位结果显示,ZmEREB93蛋白定位于细胞核。与野生型株系相比,转基因拟南芥株系种子的长和宽显著变小且千粒重显著降低。体外Chip-seq与共表达分析结果表明,Zm00001d013611、Zm00001d006016、Zm00001d027448及Zm00001d039991为ZmEREB93转录因子的候选靶基因。Y1H试验表明,ZmEREB93蛋白可直接结合Zm00001d013611启动子。【结论】玉米ZmEREB93作为转录因子在种子中特异性表达,负调控种子大小。     

CmWRKY15-1通过水杨酸信号通路调控菊花白色锈病抗性

【目的】菊花白色锈病是菊花重要病害之一,严重影响其观赏品质。分析CmWRKY15-1在菊花抗白色锈病中的功能及防卫机制,为利用分子育种解决菊花产业中白色锈病病害问题提供借鉴。【方法】以菊花白色锈病抗病品种‘黄莺’为试验材料,构建CmWRKY15-1过表达载体与干扰载体,通过农杆菌介导法转化菊花,分别获得超表达与沉默植株株系,通过表型观察、病情指数统计及转基因植株内源SA含量变化、SA合成关键基因及病程相关基因的表达分析,探究CmWRKY15-1在水杨酸信号途径响应菊花白色锈病的功能。【结果】经遗传转化后获得超表达植株OE-9株系与沉默植株RNAi-4株系,接种后的表型鉴定和病情指数调查中RNAi-4株系病情指数为53.67,抗性反应表现为感病,而野生型植株接菌前后表型无变化,表明CmWRKY15-1的沉默降低了‘黄莺’对白色锈病的抗性。同时OE-9株系中内源水杨酸含量在接种前后与WT相比呈上升趋势,而RNAi-4株系中水杨酸含量降低,即CmWRKY15-1的过表达与沉默分别显著上调和下调内源SA含量,对SA的积累有正向调节作用。OE-9系、RNAi-4系和WT在接菌处理前后的SA合成基因表达情况分析结果表明,在接种处理后,OE-9株系中ICS1的表达呈先增加后降低的趋势,其最高表达量为对照的3.8倍。而在RNAi-4株系中,ICS1在接种后出现降低,且一直保持较低水平。PAL在OE-9株系中的表达相较于对照增加,其最高表达量为对照的2.3倍,而在RNAi-4株系中,该基因的表达总体呈下降趋势,这与SA含量测定的变化结果基本一致,也进一步验证CmWRKY15-1通过SA介导的信号途径响应菊花白色锈病。此外,响应SA信号的病程相关基因表达分析结果显示,随着白色锈病病原菌处理时间的延长,OE-9株系中这些基因的表达除PR5外,均在40 h时出现峰值,PR5相对延后,在48 h时出现峰值。RNAi-4株系中除PR5外,其他基因的表达量显著低于WT、OE-9中的表达量。CmWRKY15-1的过表达提高了水杨酸信号途径中PR的转录水平,与此相反,CmWRKY15-1的沉默使这些基因表达下调。【结论】CmWRKY15-1对菊花抗白色锈病具有正调控作用,且通过水杨酸介导的信号途径调控抗病。     

青稞Hva1-hv基因对小麦的遗传转化研究

本研究通过根癌农杆菌介导,将克隆自强抗旱青稞品种的LEA3蛋白编码基因Hva1-hv转化到小麦品种Bobwhite中.经除草剂草丁膦筛选和分子检测,鉴定出4个稳定遗传的转基因小麦株系.结果表明,在干旱胁迫条件下,经T2代植株的RT-PCR分析表明,目的基因能在转基因植物中正常表达.采用离体叶片失水率作为衡量植物抗旱能力的指标,发现干旱胁迫条件下,4个T2代转基因小麦株系的离体叶片失水率较受体材料显著降低,证明转基因植株的抗干旱胁迫能力强于受体材料.本研究结果初步显示,Hva1-hv基因在抗旱小麦品种培育方面具有潜在应用价值.     

OsMas1, a novel maspardin protein gene,confers tolerance to salt and drought stresses by regulating ABA signaling in rice

Drought and salt stresses, the major environmental abiotic stresses in agriculture worldwide, affect plant growth, crop productivity, and quality.  Therefore, developing crops with higher drought and salt tolerance is highly desirable.  This study reported the isolation, biological function, and molecular characterization of a novel maspardin gene, OsMas1, from rice.  The OsMas1 protein was localized to the cytoplasm.  The expression levels of OsMas1 were up-regulated under mannitol, PEG6000, NaCl, and abscisic acid (ABA) treatments in rice.  The OsMas1 gene was introduced into the rice cultivar Zhonghua 11 (wild type, WT).  OsMas1-overexpression (OsMas1-OE) plants exhibited significantly enhanced salt and drought tolerance; in contrast, OsMas1-interference (OsMas1-RNAi) plants exhibited decreased tolerance to salt and drought stresses, compared with WT.  OsMas1-OE plants exhibited enhanced hypersensitivity, while OsMas1-RNAi plants showed less sensitivity to exogenous ABA treatment at both germination and post-germination stages.  ABA, proline and K⁺ contents and superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), and photosynthesis activities were significantly increased.  In contrast, malonaldehyde (MDA), hydrogen peroxide (H₂O₂), superoxide anion radical (O₂^-·), and Na⁺ contents were significantly decreased in OsMas1-OE plants compared with OsMas1-RNAi and WT plants.  Overexpression of OsMas1 up-regulated the genes involved in ABA signaling, proline biosynthesis, reactive oxygen species (ROS)-scavenging system, photosynthesis, and ion transport under salt and drought stresses.  Our results indicate that the OsMas1 gene improves salt and drought tolerance in rice, which may serve as a candidate gene for enhancing crop resistance to abiotic stresses.     

盐生植物盐爪爪液泡膜钠氢反向运输载体基因(KfNHX1)遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定

【目的】 研究盐爪爪液泡膜Na⁺/H⁺反向运输载体KfNHX1 (AY825250) 基因的耐盐功能,为耐盐育种提供候选基因。【方法】 采用农杆菌介导花序浸染的方法,将KfNHX1转入拟南芥中,结合基因组PCR和RT-PCR方法鉴定符合3∶1分离比的转基因株系;利用在盐胁迫下的萌发率、根长和表型分析,结合原子吸收分光光度计法测定叶片的Na⁺、K⁺含量,推断其耐盐性。【结果】 对抗生素筛选符合3∶1的转基因纯合株系进行基因组PCR和RT-PCR分析,证实KfNHX1基因在拟南芥基因组中整合和表达。盐胁迫下转基因株系的拟南芥种子的萌发率和根长明显高于野生型。200 mM NaCl胁迫处理15 d的拟南芥成苗,相较野生型叶片萎黄和死亡,转基因植株的生长表型较好,且积累了较高的Na⁺和K⁺。外源ABA的处理下,转基因植株的发芽率和生长表型也好于野生型。【结论】 盐爪爪(Kalidium foliatum)是一种藜科(Chenopodiaceae)盐生灌木,对盐的耐受性很强。液泡膜Na⁺/H⁺反向运输体(NHX)是在离子稳态中起重要作用的膜蛋白,通过调节胞间离子的跨膜转运来维持细胞内离子和pH平衡。盐生植物盐爪爪KfNHX1能够提高转基因拟南芥的耐盐性,具有提高植物耐盐性的潜力。     

玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和 干旱胁迫的功能鉴定

【目的】质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）广泛存在于植物细胞的膜系统上,在植物体内水分运输和水分平衡的过程中至关重要。对ZmPIP2;6在植物水分胁迫耐性中的功能进行探究,为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀基因资源。【方法】分析并比对ZmPIP2;6与其他物种中报道参与水分胁迫的PIPs的氨基酸序列,构建ZmPIP2;6-GFP载体并通过PEG介导转化玉米原生质体,对ZmPIP2;6进行亚细胞定位。采集玉米的不同组织样品,包括根、茎、叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳;对玉米进行PEG或NaCl处理,在处理的不同时间点采集玉米的根和叶样品。提取总RNA并通过qRT-PCR调查ZmPIP2;6在玉米不同组织以及在水分胁迫下的表达模式。构建ZmPIP2;6超表达载体,发展并鉴定ZmPIP2;6超表达拟南芥材料,观察转基因植株对渗透、盐及干旱胁迫的耐性生理表型,并测量其根长、叶片水分散失率等性状。检测在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达。【结果】氨基酸序列分析比对结果显示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型结构与并且其他物种的PIP蛋白具有很高的同源性。转化玉米原生质体试验结果显示ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜。qRT-PCR结果显示ZmPIP2;6在玉米未成熟雄穗中表达量最高,并且在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中的ZmPIP2;6表达受到显著诱导。在MS固体培养基上进行渗透胁迫处理和盐胁迫处理以及进一步的土培试验中进行干旱胁迫处理,ZmPIP2;6超表达拟南芥植株相对野生型都显示出更强的胁迫耐性。在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达受到不同程度的影响。【结论】玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6在渗透或盐胁迫下表达上调,在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透、盐和干旱胁迫的耐性,并且在盐或干旱胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。ZmPIP2;6可能参与植物水分胁迫响应过程。     

玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达分析

【目的】分析研究玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达。【方法】使用NCBI Blast、DNAMAN和MotifScan等程序分析玉米钙依赖蛋白激酶CDPK的蛋白结构域和系统发育。采用Real-time RT-PCR方法分析CDPK基因在干旱胁迫处理玉米幼苗中的表达,评价CDPK基因对玉米干旱胁迫反应能力。【结果】鉴定出了在玉米中含有39个CDPK基因。将CDPK基因分为4个组。每个群体中的成员有共同的蛋白质基序和外显子及内含子结构,共同的进化起源。39个玉米CDPK基因根据它们的系统发育关系分组,并锚定在特定的玉米染色体上。多数CDPK基因在玉米干旱胁迫中的表达水平发生改变,CDPK基因参与对干旱胁迫的响应。【结论】从玉米基因组数据库中鉴定出了39个CDPK基因,大多数玉米CDPK基因在不同组织和不同发育阶段表现出不同的表达水平,CDPK基因在玉米发育中发挥不同的作用。多数CDPK基因在干旱胁迫下的表达量均发生变化。     

NaCl处理谷子萌发期种子的转录组学分析

【目的】谷子具有抗旱、耐贫瘠的特性,逐渐成为研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期筛选并获得的谷子耐盐品种和敏感品种为材料,通过RNA-Seq测序筛选鉴定谷子的盐胁迫响应基因,揭示其响应盐害机制,为培育谷子抗盐新种质提供理论依据。【方法】 对14个谷子品种进行了萌发期抗盐筛选。谷子不同品种的种子经150 mmol·L ^-1NaCl处理萌发培养7 d后,分别统计各品种种子的萌发率、根长和芽长,综合各项指标鉴定到豫谷2为耐盐品种、安04为盐敏感品种。以这两个品种盐胁迫前、后萌发期种子为材料,应用RNA-Seq进行转录组测定,分析鉴定盐害下差异表达基因（differentially expression gene,DEG）,并对DEG进行GO和KEGG功能富集分析。同时应用qRT-PCR对随机挑选的15个DEG表达模式进行验证,并与RNA-Seq结果进行相关性分析。 【结果】 耐盐品种豫谷2、盐敏感品种安04种子经盐胁迫处理后,分别鉴定出2 786个和4 413个DEG;其中,每个品种在NaCl处理前及处理后分别鉴定出1 470和3 826个DEG。GO和KEGG聚类分析显示,NaCl处理下参与信号转导、抗氧化、有机酸的合成及转运以及次生代谢等相关的DEG在谷子萌发期种子应对盐胁迫响应过程中具有关键性的作用,DEG主要集中在胁迫响应、离子的跨膜转运、氧化还原、次生代谢及有机酸、多胺、苯丙烷的合成等过程。qRT-PCR对15个DEG表达模式的检测结果与RNA-seq结果相关系数为0.8817。其中编码离子通道的基因（HKT）、过氧化物酶基因（POD）、黄烷酮-3-羟化酶基因（FL3H）、MYB转录因子基因等在豫谷2中表达量较高,显示其在谷子萌发期种子响应盐胁迫中可能发挥一定作用。【结论】 谷子耐盐品种及盐敏感品种的种子对盐胁迫的响应程度具有一定的差异性,且品种对盐害的耐受能力主要与基因对胁迫的响应程度相关,而与DEG的数量相关性不大。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因

【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组,鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因,从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油821的叶片总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜染色体v1.5和甘蓝Scaffold v1.0为参考序列,采用TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff标准流程进行差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）筛选。对上调和下调DEGs分别采用Cytoscape v3.1.0中的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各3个,以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】过滤低质量reads后,ZY和ZY8D分别保留了26 192 312和28 378 899对高质量reads用于DEGs筛选,其中86.6%和85.8%的reads能准确比对到参考序列上,说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因1 431个,下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应相关,其中,参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid,ABA）刺激响应的基因分别有127和141个,而下调表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid,SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物-病原菌互作和植物激素ABA、SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号转导途径。qRT-PCR检测6个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】RNA-Seq分析鉴定出3 657个甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。     

玉米钙依赖蛋白激酶38(ZmCDPK38)的生物信息学及表达特性分析

【目的】 研究ZmCDPK38与其它物种中同源基因之间的遗传进化关系,通过与亲缘关系较近且功能已知的同源基因比较,对ZmCDPK38的功能进行理论预判。确定ZmCDPK38基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【方法】 生物信息学分析使用在线分析工具及MEGAX软件;基因表达分析采用Real-time PCR。【结果】 ZmCDPK38与ZmCDPK28及高粱等6个其它植物物种的CDPK的氨基酸序列具有较高的一致性,遗传进化关系上较近。氨基酸序列包含4个结构域,具有CDPKs家族氨基酸的典型特征,Ser/Thr蛋白激酶结构域相对保守。ZmCDPK38基因在叶片中的表达量最高,其次是茎部、根、雄穗及雌穗;受盐胁迫及干旱胁迫诱导,ZmCDPK38基因的表达水平显著上升,在低温和高温胁迫条件下基因表达未见明显变化。【结论】 ZmCDPK38基因作为CDPK家族成员,在蛋白序列和结构上具备典型的CDPK家族成员特征;ZmCDPK38基因响应干旱胁迫与盐胁迫,可能在干旱应答与盐胁迫应答反应中发挥一定的功能。