干旱胁迫下玉米开花期雄穗差异表达蛋白质的鉴定与筛选

【目的】 研究玉米开花期不同耐旱性玉米自交系的蛋白质表达差异,分析玉米响应干旱胁迫的主要代谢途径并发掘有价值的耐旱基因,对响应干旱胁迫的差异表达蛋白质组进行筛选和鉴定分析。【方法】 以强耐旱系PHBA6和弱耐旱系吉63为材料,设计干旱胁迫和正常灌溉处理。在玉米开花期进行干旱胁迫处理,取雄穗小花提取蛋白经双向凝胶电泳分离、凝胶图像扫描和质谱分析。【结果】 质谱分析共筛选出542个高清晰、重复性强的蛋白质点。其中,差异表达丰度达2.0倍以上的蛋白质点共有59个,强耐旱系PHBA6中有26个,弱耐旱系吉63中有37个,在强耐旱系PHBA6与弱耐系吉63中都表达且差异显著的蛋白质点有4个。【结论】 干旱胁迫蛋白参与代谢物和能量前体合成、核苷酸代谢、氧化还原辅酶代谢过程、蛋白翻译调控、细胞蛋白质及氨基酸代谢过程的调控、含硫化合物的合成与代谢过程、半胱氨酸的生物合成及代谢过程和光合作用等。细胞组分分类显示二者中的差异蛋白都与叶绿体及其结构相关,而且差异蛋白的细胞组分分类一致,但在生物学代谢过程及分子功能分类上相差较大,这些显著的差异表达的蛋白可能是形成不同品系间耐旱性强弱的主要原因。     

深度测序鉴定玉米雄穗花器官分化期响应干旱胁迫的miRNA和其靶基因

【目的】 运用现代分子生物学及高通量测序技术,研究不同品种玉米雄穗花器官分化期响应干旱胁迫的差异miRNA和其靶基因,挖掘和鉴定与玉米发育相关的基因,分析其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】 以耐旱自交系"PHBA6"和干旱敏感自交系“吉63”为研究对象,应用深度测序技术进行miRNA文库构建,鉴定其差异表达的 miRNA,对差异表达mi RNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集。【结果】 鉴定了总共337种前体miRNA,其中包含289种已知的miRNA和48种新的miRNA。在3个文库,两个分组中共有155种差异表达miRNA。基于GO功能分类及遗传和基因组(KEGG)的功能富集显示,这些miRNA可能通过靶向一系列与胁迫相关的基因而在干旱胁迫中发挥作用。至少55个预测的靶基因进一步被60个miRNA调控。NAC,MYB和MAPK基因家族在干旱胁迫下评分最高,在植物抗旱中重要作用。一系列miRNA与这些排名靠前的基因相关,包括miR164、miR172、miR1520、miR6158、ghr-n24、ghr-n56等。【结论】 miRNAs可能在玉米雄穗花器官分化期耐旱中发挥重要作用,miRNAs的筛选为分子辅助育种和转基因育种将提供新的靶标。     

新疆野苹果幼苗叶片响应NaCl胁迫的miRNAs及靶基因筛选

【目的】 筛选新疆野苹果响应NaCl胁迫相关差异miRNA及靶基因。【方法】 以新疆野苹果组培苗为材料,对150 mmol/L NaCl处理6和48 h时的新疆野苹果幼苗叶片进行small RNA测序。【结果】 NaCl处理6 h时3个miRNA差异表达,其中2个上调表达,1个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为64个;NaCl处理48 h时13个miRNA差异表达,其中4个上调表达,9个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为108个。对差异靶基因进行GO和KEGG分类注释,NaCl处理6 h时,GO主要富集包括:肌醇磷酸2激酶活性、寡糖基转移酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂活性、木聚糖生物合成过程等;NaCl处理48 h时,GO主要富集包括:氧氧化还原酶活性、DNA结合、质外体、次生代谢过程等。KEGG共同富集在N-glycan生物合成通路。【结论】 mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f、mdm-miR171i、mdm-miR399j基因在NaCl处理6和48 h时表达量存在差异,其中mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表达量呈负相关,3个miRNA参与了新疆野苹果对NaCl胁迫的响应过程。     

玉米钙依赖蛋白激酶38(ZmCDPK38)的生物信息学及表达特性分析

【目的】 研究ZmCDPK38与其它物种中同源基因之间的遗传进化关系,通过与亲缘关系较近且功能已知的同源基因比较,对ZmCDPK38的功能进行理论预判。确定ZmCDPK38基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【方法】 生物信息学分析使用在线分析工具及MEGAX软件;基因表达分析采用Real-time PCR。【结果】 ZmCDPK38与ZmCDPK28及高粱等6个其它植物物种的CDPK的氨基酸序列具有较高的一致性,遗传进化关系上较近。氨基酸序列包含4个结构域,具有CDPKs家族氨基酸的典型特征,Ser/Thr蛋白激酶结构域相对保守。ZmCDPK38基因在叶片中的表达量最高,其次是茎部、根、雄穗及雌穗;受盐胁迫及干旱胁迫诱导,ZmCDPK38基因的表达水平显著上升,在低温和高温胁迫条件下基因表达未见明显变化。【结论】 ZmCDPK38基因作为CDPK家族成员,在蛋白序列和结构上具备典型的CDPK家族成员特征;ZmCDPK38基因响应干旱胁迫与盐胁迫,可能在干旱应答与盐胁迫应答反应中发挥一定的功能。     

26份自交系田间抗旱性鉴定与评价

【目的】分析26份玉米自交系的主要农艺性状、籽粒产量、耐旱指数、耐旱系数等性状相关性,进行耐旱性综合性评价。【方法】采用玉米种质耐旱指数法。【结果】玉米开花期,遭遇大气高温和土壤缺水会导致玉米花粉活力下降,受精结实不良,减产严重。各主要性状与籽粒产量的相关系数大小为耐旱指数＞穗位＞穗长＞ASI＞行粒数＞秃尖长＞穗行数。其中耐旱指数、穗位、穗长、株高、ASI值、行粒数等籽粒产量正相关;秃尖长等与籽粒产量负相关。【结论】26份自交系中耐旱强的自交系共11份(42.31%),耐旱性中等的7份(26.92%);耐旱性较弱的材料8份(30.77%)。     

旱胁迫相关绿豆VrERF家族基因发掘及表达分析

【目的】探究AP2/ERF转录因子在绿豆干旱胁迫响应中的应答机制。【方法】基于全基因组测序数据对绿豆VrERF家族基因的种间同源性、互作蛋白功能及顺式作用元件进行分析，通过转录组测序数据分析各VrERF基因的组织特异性表达、干旱胁迫下基因表达差异情况并用q RT-PCR进行验证。【结果】绿豆与豌豆、菜豆和大豆的ERF家族基因间不仅具有相同的进化起源，还存在明显的基因扩张现象。VrERF基因启动子区均具有多个与激素响应、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。此外，不同的绿豆VrERF蛋白间存在广泛的互作关系，可能通过与b ZIP、RAP2.4和STZ等蛋白互作参与绿豆非生物胁迫的防御响应。基因表达分析显示，多数VrERF家族基因的表达具有较强的组织特异性，且在干旱胁迫下，VrERF7/62在绿豆VC1973A和JP226873叶片中均显著下调表达，qRTPCR检测也显示VrERF7/62的表达受干旱胁迫诱导显著下调。【结论】推测VrERF7/62可能在绿豆干旱胁迫响应过程中起负调控作用，结果也为绿豆AP2/ERF家族基因的抗逆性表达及基因功能研究奠定了基础。     

白桦BpERF1和BpERF2基因的克隆与表达模式分析

【目的】对白桦Bp ERF1和Bp ERF2基因进行生物信息学分析及非生物胁迫下的表达模式分析,为白桦抗逆育种提供重要基因源和理论依据。【方法】从白桦转录组数据库中找到2条ERF基因,通过生物学网站及软件对其进行生物信息学分析;通过RT-PCR分析盐和干旱胁迫下2个ERF基因的表达模式。【结果】Bp ERF1蛋白含有2个核定位信号,Bp ERF2蛋白含有1个核定位信号;两个ERF蛋白的结构域均含有3个反向平行的β折叠和一个α螺旋;Bp ERF1和Bp ERF2都属于ERF亚家族成员;在Na Cl胁迫下,Bp ERF1基因在根和叶中的相对表达量与对照相比呈上调表达的趋势;Bp ERF2基因在根茎叶中均呈下调表达的趋势;在PEG胁迫下,两个基因的表达模式与Na Cl相似。【结论】生物信息学分析结果推测Bp ERF1和Bp ERF2基因可能参与植物对生物和非生物胁迫的应答;2个ERF基因均可以不同程度地被高盐和干旱胁迫所诱导,但不同ERF基因在胁迫下的表达模式存在差异,ERF基因的表达具有组织特异性,说明2个ERF基因可能通过不同的调控机制来应答逆境胁迫。     

盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。     

玉米自交系响应高温、干旱胁迫的关键基因及通路

以4个不同的玉米自交系为材料,对高温、干旱处理后的苗期植株进行转录组测序.玉米自交系响应高温和干旱胁迫的差异表达基因(DEGs)分别为6966和6272个,在高温和干旱胁迫下4个玉米自交系相同的DEGs分别是705和871个.同时响应高温和干旱的DEGs有100个.在耐旱、耐热性强的玉米自交系中鉴定出18个特异的DEGs,其中锌指转录因子、WRKY转录因子、GT转录因子和B2热激转录因子在胁迫响应中发挥关键的调控作用.KEGG通路分析结果表明,耐旱、耐热性强玉米自交响应高温干旱胁迫的DEGs富集在生物学过程、分子功能、代谢过程、遍在蛋白代谢和氮代谢途径5条通路.热带、亚热带玉米种质的耐旱、耐热性强于温带玉米种质,可在热带、亚热带玉米种质中有效筛选耐旱、耐热基因.     

红橘响应褐斑病菌侵染的转录组学分析

【目的】 明确红橘（Citrus reticulata Blanco, cv. Hongjv）接种褐斑病致病菌——链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）后基因种类和表达量在转录水平的变化规律,确定红橘响应该致病型侵染的关键基因。【方法】 采用链格孢菌橘致病型接种红橘离体叶片,28 h后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA,进行转录组高通量测序,然后利用生物信息学分析,以甜橙基因组为参考,以|log₂ fold change|≥1,q-value≤0.01为阈值选取感病和健康红橘叶片转录组的差异表达基因,应用GO数据库对差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）进行功能分类,KEGG分析代谢途径,MapMan软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。【结果】 红橘接种链格孢菌橘致病型28 h后产生大量与胁迫相关的差异表达基因,获得上调差异基因5 173个,下调差异基因6 555个。GO功能分类显示差异基因主要与蛋白结合、膜、氧化还原过程等相关。通过KEGG富集和MapMan软件分析发现,红橘在受链格孢菌橘致病型胁迫的过程中基础代谢被严重破坏。乙烯、水杨酸和生长素等寄主防御相关的植物激素信号转导途径多个基因表达出现差异,其中乙烯起主导作用,乙烯受体ETR 3个成员被不同程度激活,下游激酶和乙烯响应因子均上调,生长素大部分关键信号基因、绝大部分生长素响应因子ARF和水杨酸合成途径的基因均下调表达。同时,黄酮醇、花青素、萜类化合物和生物碱合成相关基因受该菌诱导显著变化,萜类合成中大部分基因下调,而黄酮类合成相关上调基因数量和表达趋势均强于表达下调基因,有抗虫和抑菌作用的硫代葡萄糖苷基因呈上调趋势。进一步研究发现,大量参与抗逆过程的转录因子如WRKY、bZIP、ERF、MYB、NAC被诱导激活,其中大部分WRKY和bZIP转录因子受该菌正向调控,超过50%的ERF家族基因表达上调;在转录因子调控下,PTI及ETI响应基因如受体激酶、R蛋白、NBS抗病蛋白等大量表达,多个PR家族抗菌蛋白基因上调表达,22个抗氧化保护酶系统POD成员基因受到活性氧信号激发大量表达。以上结果表明链格孢菌橘致病型侵染对寄主内部生理状态产生显著影响。选取了19个与植物抗病相关基因进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】 获得了红橘响应链格孢菌橘致病型侵染的差异表达基因及显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及转录调控等条目中,这些基因的相互协同调控是红橘对该致病型产生防御反应的重要机制。     

提高玉米抗旱鉴定准确性的水旱交替种植模式分析

【目的】研究玉米水旱交替种植模式鉴定法,为准确鉴定玉米抗旱性提供理论依据。【方法】以157份玉米自交系为材料,测定水旱交替种植模式法和常规水旱分区法的三重复的抗旱系数,利用三重复之间的相关系数对比研究两种方法的优劣。【结果】常规水旱分区鉴定的抗旱性,三重复间的相关系数为0.692~0.755(平均值 0.724),而水旱交替种植模式鉴定的抗旱性,三重复间的相关系数为0.835~0.887(平均 值0.861);水旱交替种植模式鉴定法重复间相关系数要高出常规水旱分区鉴定法18.9%。【结论】与常规的水旱分区鉴定法相比,水旱交替种植模式抗旱鉴定法具有更高的准确性和重复性,且便于材料观察的特点,可用于玉米抗旱性大规模鉴定。     

玉米自交系JH089种子萌发及幼苗生长的抗逆性

【目的】研究玉米优良自交系JH089在不同胁迫下种子萌发特性及幼苗生长情况,分析其对各种胁迫的耐受性,研究自交系JH089的抗逆性,为选育抗逆杂交种提供理论依据。【方法】以玉米自交系JH089为材料,在萌发期及2叶期进行不同浓度NaCl(100、200、250、300、400、500 mmol/L)、PEG 6000(10%、20%、30%)及4℃胁迫处理,测定萌发率、抗旱指数、株高、叶形等指标。【结果】玉米自交系JH089在萌发期随着NaCl或PEG处理浓度的增加,萌发所需时间延长,活力指数及抗旱耐盐指数下降。在幼苗期盐浓度高于200 mmol/L 或者PEG高于20%时株高、叶长和叶宽显著降低,出苗率大幅下降,植株生长显著减缓,叶片受胁迫程度明显,较长时间低温处理幼苗生长受到抑制。【结论】玉米自交系JH089能耐受低浓度的盐或旱胁迫,短时间低温对幼苗生长无显著影响,但较高强度或较长时间胁迫则造成明显伤害。     

非生物胁迫对不同玉米杂交种苗期生长的影响

【目的】研究非生物胁迫对不同玉米杂交种苗期生长的影响,比较其适应非生物胁迫的能力,为玉米杂交种的生产提供参考依据。【方法】以3种玉米杂交种新玉47号、九玉J03、九圣禾2468为材料,分别用PEG 6000、NaCl、低温、强光胁迫处理一周后,测定3种杂交种幼苗株高、茎粗、叶面积等各种生长指标。【结果】不同非生物胁迫对玉米幼苗株高、茎粗、叶面积、相对含水量等均有不同程度的抑制作用,3种玉米品种的抗逆性表现各不相同。九玉J03适应盐和低温的能力较强;九圣禾2468适应旱、强光的能力较强;而新玉47号在这些非生物胁迫下均表现一般。【结论】3个不同地区种植的玉米杂交种对环境的适应能力各不相同。     

Differential Gene Expression in Response to Drought Stress in Maize Seedling

To provide the useful information for the choice of molecular marker used in marker-assisted selection of drought tolerance, it is necessary to find out more candidate genes and fulfill the information gaps in gene expression regulation under drought stress. In this study, we isolated four differentially expressed cDNA fragments from leaves of a droughttolerant inbred line by suppression subtractive hybridization and reverse Northern hybridization, and validated their differential expression patterns among six inbred lines with different drought tolerance in response to drought stress by quantitative real-time PCR. Sequence similarity analysis indicated that two of four differentially expressed cDNA showed homology to gene DegP encoding trypsin-like serine protease, and gene PGAM-i encoding cofactor-independent phosphoglyceromutase, respectively. Expressions of the genes corresponding to four cDNA fragments was decreased at 6 h after drought stress treatment in most of the six inbred lines, and then returned to the control level with further stress in three of the tolerant inbred lines. The expression of the gene PGAM-i and the genes corresponding to fragments E4 and F4 were increased to a high level in tolerant inbred line 81565. In the two drought-sensitive inbred lines （Dan340 and ES40）, the expression of these genes was still down-regulated. The probable mechanisms of these genes in response to drought stress were discussed. These results indicated that the drought-tolerant inbred lines upregulated the expression of the drought-tolerant candidate genes, in contrast, drought-sensitive inbred lines downregulated the expression of the genes.     

中国美利奴羊羊毛弯曲相关microRNA的筛选

【目的】 研究miRNA在不同羊毛弯曲中国美利奴羊皮肤组织中的表达差异及其可能参与的调控通路,筛选出与中国美利奴羊羊毛弯曲相关的miRNA,为进一步探究细毛羊羊毛弯曲性状的调控机理提供理论依据。【方法】 运用高通量测序技术对羊毛弯曲频率有极端差异表型值(大弯曲组与小弯曲组)细毛羊个体皮肤的miRNA组进行测序与比较分析。【结果】 共鉴定出425个miRNAs,其中包括143个已知miRNAs和282个新发现的miRNAs。在大弯曲组与小弯曲组共筛选到8个上调和17个下调的miRNAs。对差异miRNA的预测靶基因进行简单的Gene Ontology与KEGG Pathway富集分析。差异表达的miRNA的靶基因主要参与跨膜信号受体活动、信号转导活动、分子转导活动、膜的组成等过程。15 761个靶基因注释到252个信号通路。【结论】 筛选出了25个与细毛羊羊毛弯曲性状相关的候选miRNAs。     

2个不同耐旱性棉花品种光合特性和干物质累积对干旱的响应

【目的】 研究抗旱性不同的棉花品种叶片光合生理特性及干物质累积与分配对干旱的响应机制,为棉花抗逆栽培和耐旱性品种选育提供理论依据。【方法】 在土柱栽培的条件下,以棉花品种新陆早17号(敏旱型)和新陆早22号(耐旱型)为材料,设常规灌溉(4 500 m³/hm²,CK)、轻度干旱(2 700 m³/hm²,W1)和中度干旱(900 m³/hm²,W2)水分处理,测定棉花产量形成期叶面积、叶绿素含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数和干物质累积与分配的变化。【结果】 2个棉花品种的叶面积、叶绿素a含量(Chl a)、叶绿素b含量(Chl b)、叶绿素总含量(Chl)、净光合速率(Pn)、气孔导度(gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)均随干旱胁迫程度的增加显著降低,品种间以新陆早22号降幅较小。与CK相比,W1条件下2棉花品种的最大光化学效率(Fv/Fm)并未显著降低,但新陆早17号的实际光化学效率[Y(II)]和光化学猝灭系数(qP)受到抑制,且轻度和中度干旱下非光化学淬灭系数(NPQ)在盛铃期显著增加。在W1条件下,新陆早17号吐絮期的生殖器官和营养器官干物质分别比CK下降了30.44%和16.61%,新陆早22号仅下降12.50%和5.74%。CK、W1、W2条件下,新陆早22号的根冠比在盛铃期较新陆早17号高2.54%、9.56%和14.48%。【结论】 耐旱性较强的棉花品种新陆早22号通过保持更好的光合性能和较大的根冠比,来保持生殖器官干物质的累积以适应干旱胁迫。