AtDREB1A基因过量表达对马铃薯生长及抗非生物胁迫基因表达的影响

为明确AtDREB1A基因过量表达对马铃薯生长及基因表达的影响,以马铃薯品种陇薯3号(L3)及其AtDREB1A转基因株系T2为材料,采用盆栽试验,在马铃薯盛花期将盆土含水量控制为田间最大持水量(FWC)的45%～50%,观察转基因前后植株表型,并研究叶片MDA含量、RWC、SOD和POD活性及其基因表达的差异。结果表明,正常浇水条件下2个株系各指标差异不大。胁迫20 d后,转基因植株T2的表型明显好于对照L3,且RWC显著高于L3;各株系叶片的MDA含量、SOD和POD活性均明显上升,但转基因植株MDA含量上升幅度较对照小,抗氧化保护酶SOD、POD活性升高幅度较对照大,说明转基因植株细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻,植株的耐旱性明显提高。转录组测序及生物信息学分析发现,转基因材料T2相对于L3的差异表达基因共430个,其中上调表达基因287个,下调表达基因143个。功能注释和显著性富集结果表明,差异表达基因富集涉及GO功能分类体系中生物过程、细胞组分和分子功能3个大类别,且大部分集中在细胞内和膜上,主要涉及信号传导、氧化还原、生物调解、应激反应、发育过程、系统免疫过程、核酸和蛋白结合转录因子活性、转运活性及催化活性。其中抗非生物胁迫相关蛋白PPR、HSP、P450、MLO等家族的大量基因表达量发生较大变化,说明这些基因在转AtDREB1A基因马铃薯抵御干旱过程中发挥着非常重要的作用。本研究为进一步解析AtDREB1A基因提高马铃薯抗旱性的调控网络奠定了基础。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因提高马铃薯的抗旱性

本研究以过表达截形苜蓿类型ⅠH~+-焦磷酸酶编码基因MtVP1的转基因马铃薯为材料,对其抗旱性进行了检测。结果显示:(1)在正常生长条件下,与野生型植株相比,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性差异均不显著,而脯氨酸含量均高于野生型植株,其中OE2株系脯氨酸含量显著高于野生型植株。随着干旱胁迫的持续,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量的下降趋势平缓,其含量均显著高于野生型对照,且两个转基因株系的脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型对照,而转基因株系的MDA含量显著低于野生型植株。(2)转MtVP1马铃薯表现出表皮毛增多的新表型,茎和叶表面的表皮毛明显比野生型植株多。以上结果表明,Mt VP1基因的过表达提高了马铃薯的渗透调节能力,从而增强了马铃薯的抗旱性;还表明植物类型ⅠH~+-焦磷酸酶基因可能参与调控其他的代谢通路,具有更复杂的生理功能。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。     

大豆热激转录因子GmHsFA1对高温和干旱信号的表达反应

本研究将热激转录因子GmHsFA1基因构建在植物表达载体pCAMBIA3300中,以大豆子叶节作为受体,通过农杆菌介导法将热激转录因子GmHsFA1基因导入到高产品种黑农53中,获得一批转基因株系。采用Real-time PCR的方法对各代株系GmHsFA1基因的转录水平进行相对定量分析,确定转基因大豆中热激转录因子GmHsFA1的表达量明显提高。利用转热激转录因子GmHsFA1大豆研究了高温和干旱胁迫下,大豆热激转录因子GmHsFA1应对高温和干旱信号的基因表达,生理生化特性,光合特性及产量性状的变化反应,采用胁迫系数与灰色关联分析相结合方法,对转GmHsFA1基因大豆的耐热性和抗旱性进行综合鉴定和评价。结果表明:转热激转录因子GmHsFA1大豆品系在高温和干旱诱导条件下,大豆叶片中GmHsFA1、GmHSP70、GmHSP22和GmHSP17.9基因的表达量明显高于非转基因受体黑农53,叶肉细胞中的脯氨酸含量和可溶性糖含量明显高于受体,丙二醛含量增幅较小,叶片的光合特性受胁迫变化较小,光合特性能力和产量性状表现高于受体,表明过量表达的热激转录因子GmHsFA1大豆植株的耐热能力和抗干旱能力得到明显的提高。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

水稻锌指蛋白基因OsBBX24响应热胁迫的研究

环境因子光和温度对植物生长发育起重要调控作用,OsBBX24基因属于光温信号途径重要的调控元件B-box(BBX)家族基因成员。OsBBX24基因启动子序列分析发现其含有HSE热胁迫相关元件,水稻基因芯片数据分析发现其表达受热诱导,实时定量PCR分析进一步证明OsBBX24基因受热胁迫表达上调。热胁迫处理发现OsBBX24-RNAi转基因水稻材料株系苗期的耐热性比野生型Kitaake要弱,且超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性比野生型低,脯氨酸含量也低于野生型,丙二醛含量比野生型高;热激转录因子HsfA2a及热激蛋白Hsp16.9、Hsp60热胁迫处理后野生型中的表达水平比OsBBX24-RNAi株系高。由此证实,OsBBX24基因在水稻响应热胁迫表现为正调控,为深入研究其响应热胁迫分子机理及作用机制奠定基础。     

转ER-sHSP基因番茄植株的耐盐性检测

热激蛋白在植物应对各种环境胁迫的应答中执行重要的功能并存在交叉保护现象。前期结果表明内质网小分子热激蛋白（ER-sHSP）的过量表达能够显著增强转基因番茄的抗冷能力,为继续深入研究ER-sHSP的生理功能,本文对高盐胁迫下转ER-sHSP基因番茄的耐受性进行了检测,结果显示：与对照相比,转基因番茄抗性表型明显,持有较高的植物干鲜重,脯氨酸含量大幅度提高,SOD酶活性增加明显,而MDA含量和电导率则较低。说明ER-sHSP的过量表达提高了转基因番茄的抗盐胁迫能力     

干旱胁迫对转IrrE基因甘蓝型油菜生理生化指标的影响

以转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜为材料,用10%(W/V)PEG6000(聚乙二醇)进行了干旱胁迫实验,比较研究了转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜幼苗的耐受性应答情况。结果表明:转基因油菜植株含水量下降趋势小于非转基因油菜植株;转基因油菜植株叶绿素含量和荧光参数F0的上升趋势均明显大于非转基因油菜植株;转基因油菜植株的Fv/Fm值和可溶性蛋白含量均大于非转基因油菜植株,但丙二醛(MDA)含量小于非转基因油菜植株。以上结果从侧面证实了:在干旱胁迫下,转IrrE基因油菜植株较非转基因植株有更强的耐受能力;IrrE基因作为一种转录调节因子,广泛参与了油菜幼苗对干旱胁迫的耐受性应答过程,增强了植株的耐旱能力。     

碱胁迫相关基因GsWRKY15的克隆及其转基因苜蓿的耐碱性分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,能够参与植物多种逆境响应。本研究利用前期野生大豆盐碱胁迫RNA-seq测序数据,从构建的碱胁迫基因调控网络中筛选并克隆到GsWRKY15基因。分析GsWRKY15在碱胁迫下野生大豆根中的表达模式,发现该基因受碱胁迫诱导显著上调表达,且在胁迫后1 h表达量最高。分析GsWRKY15基因在野生大豆各组织中的表达特异性,发现该基因在各组织中均有表达,花中表达量最高。采用根癌农杆菌侵染苜蓿子叶节方法,将GsWRKY15转化肇东苜蓿,获得39株抗性植株。通过PCR、Southern blot和RT-PCR方法分析抗性植株,获得了超量表达GsWRKY15基因的转基因株系并对其进行了耐碱性分析。在150 mmol L–1 Na HCO3处理2周后转基因苜蓿生长状态良好,而非转基因苜蓿出现萎蔫、变黄,甚至死亡;非转基因苜蓿的相对质膜透性和丙二醛含量显著高于转基因苜蓿,而叶绿素含量显著低于转基因苜蓿;同时分析碱胁迫下转基因植株中胁迫相关基因的表达模式,发现H+-Ppase、NADP-ME、KIN1、RD29A基因的表达量高于非转基因苜蓿。结果表明GsWRKY15基因的超量表达能够显著增强苜蓿的耐碱能力。     

转GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析

从野生大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选并克隆到GsCBRLK基因, 与人工合成的高甲硫氨酸含量SCMRP基因构建成双价植物表达载体, 将其转入苜蓿, 获得超量表达的转基因苜蓿, 并进行耐碱性分析。结果显示, 经过100、150 mmol L^–1 NaHCO₃处理14 d后, 转基因株系生长状态良好, 而非转基因对照株系萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05), 而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P<0.05), 说明超量表达GsCBRLK基因增强了苜蓿的耐碱能力;各转基因株系的甲硫氨酸含量均比对照植株高, 表明SCMRP基因的导入提高了苜蓿叶片甲硫氨酸的含量。     

转晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因棉花及抗旱性分析

本研究将紫杆柽柳(Tamarix and rossowii Litv)晚期胚胎发生丰富蛋白(LEADQ663481)基因导入新疆早熟棉新陆早18号,通过冬季海南加代、夏季新疆继代的方法获得T3代转基因棉花株系。从40株大田卡那霉素检测阳性植株中,经过PCR筛选证明3株为阳性的转化株。在室内条件下,对转化株幼苗进行水培实验,并用12%(w/v)PEG-6000处理12h模拟干旱胁迫。结果显示,干旱胁迫之后,转LEA基因棉花基因表达量显著增加;丙二醛生成量显著降低;游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的生成量显著增加;棉花表型分析也证明了转LEA基因棉花抗旱性有提高。培养45d后,转LEA基因棉花的生物量高于非转基因棉花。本研究结果表明,在干旱胁迫条件下,转LEA基因棉花表现出了优良的生长和生理优势,显示出转LEA基因棉花能提高棉花的抗旱能力。     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southern blotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20％以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10．5％和0．383％,与对照相比分别提高了32．74％和35．34％,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。