浸泡免疫迟钝爱德华氏菌疫苗诱导牙鲆黏液细胞的动态变化

为探明鱼类黏膜相关淋巴组织中黏液细胞对疫苗免疫的应答特性,本研究利用组织学和组织化学技术,研究了浸泡免疫灭活迟钝爱德华氏菌前后牙鲆皮肤、鳃、前肠、中肠和后肠中黏液细胞数量和特性的时序变化。苏木精-曙红(HE)、阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色结果显示,免疫前皮肤主要分布含中性黏多糖的Ⅰ型黏液细胞以及含中性黏多糖和少量酸性黏多糖的Ⅲ型黏液细胞,鳃中可观察到Ⅰ、Ⅲ型以及含酸性黏多糖和少量中性黏多糖的Ⅳ型黏液细胞,前肠中主要分布Ⅰ型黏液细胞,中肠、后肠上皮中可观察到Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型和含酸性黏多糖的Ⅱ型黏液细胞。免疫后,牙鲆黏膜免疫相关淋巴组织中黏液细胞总量随时间呈现先增多后减少趋势,后肠在第5天达到峰值,其他于第3天达到峰值;免疫后各组织中Ⅰ型黏液细胞数量减少,含酸性黏多糖成分的Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型黏液细胞数量显著增多,表明疫苗免疫诱导黏液细胞成分由中性黏多糖向酸性黏多糖转变。p H 2.5和p H 1.0条件下AB染色结果显示,免疫后黏膜相关淋巴组织中酸性黏液细胞数量增多,且多数为硫酸化酸性黏液细胞。本研究结果为鱼类黏液的免疫防御功能及黏液细胞在鱼类黏膜免疫中的作用提供了理论依据。     

在斑马鱼仔鱼脑部异体移植胚胎细胞的尝试

为建立斑马鱼(Danio rerio)脑部细胞移植模型,先用红色荧光染料标记供体胚胎细胞,再移植细胞到AB品系和两种转基因斑马鱼仔鱼脑部。荧光显微镜和组织学切片观察发现移植细胞沿组织或细胞间隙而不是通过血管向周围组织扩散,但细胞增殖分化不明显。在细胞移植24 h后,脑部组织学结构与对照组无明显差别。带有白血病基因的胚胎细胞在AB仔鱼的脑部没有产生肿瘤样增生和转移。相比之下,正常胚胎细胞在白血病模型的仔鱼脑部非白血病细胞聚集区出现较多增殖和迁移。这些结果提示脑局部微环境不支持移植细胞的增殖分化;细胞移植只能弥补局部细胞的空疏而不能用作细胞替代治疗。     

影响马氏珠母贝植核育珠绩效的关键技术研究

本研究在海水珍珠养殖核心区域流沙湾,通过设置不同术前处理方法、不同配液进行小片保养和不同模式育珠三个实验,比较其对马氏珠母贝植核育珠绩效的影响。术前处理方法分别为抑制性腺、温度差促排、盐度差促排和对照组(A_1、A_2、A_3、AD);小片保养分别为配液1号、配液2号、配液3号、和对照组(B_1、B_2、B_3、BD);育珠模式分别为海区休养与育珠、池塘休养与育珠和池塘休养与海区育珠(C_1、C_2、C_3)。经休养、育珠结束后,比较其育珠绩效相关指标值的差异。实验结果显示:实验Ⅰ中各术前处理组间育珠贝的育珠绩效值差异不具有统计学意义(P0.05),而各处理组(A_1、A_2、A_3)育珠贝的成活率、留核率、成珠率、优良珠率和育珠绩效值均显著高于对照组(AD)(P0.05),其中温度差促排组(A_2)具有最高的育珠绩效值;实验Ⅱ中各不同配液保养组间育珠贝的育珠绩效值差异不具有统计学意义(P0.05);而通过细胞小片保养各组(B_1、B_2、B_3)的育珠绩效值都显著高于对照组(BD)(P0.05)。其中配液1号组(B_1)具有最高的育珠绩效值;实验Ⅲ中各不同育珠模式组间育珠贝的成活率和留核率:(C_1)与(C_2)之间差异不具有统计学意义(P0.05),而和(C_3)之间存在统计学意义;育珠贝的成珠率、优良珠率和育珠绩效值:(C_1)与(C_3)之间差异不具有统计学意义(P0.05),而和(C_2)之间存在统计学意义(P0.05),;其中池塘休养与海区育珠组(C_3)具有最高的育珠绩效值。     

低温胁迫诱导斑马鱼ZF4细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响

为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species,ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d)ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示:(1)DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P0.05)和(2.31±0.08)倍(P0.05)。(2)Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞ROS的产生;通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现p-JNK、p-p38和γH2A.X激活时间点与低温诱导ROS表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

猪耳廓软骨板细胞的体外传代培养

耳廓是哺乳动物听觉器官的重要组成部分.猪(Sus Scrofa)耳廓大小经历长期的人工驯养和选育后变异很大.目前,对猪耳廓大小的研究主要集中在遗传机理的解析,对其在细胞水平的研究还尚未完善.本研究通过酶法分离得到猪耳廓软骨板细胞并在体外培养,将原代猪耳廓细胞连续培养,用流式细胞仪分别检测从3～10代耳廓软骨板细胞的大小和分布情况,以及耳廓软骨板细胞与软骨干细胞阳性标记物CD44和CD90的结合能力.同时,将3～10代细胞分别与Annexin V-FITC/PI(细胞凋亡试剂盒)孵育,用流式细胞仪进行凋亡特性分析.通过流式细胞检测发现,体外培养的软骨板细胞由软骨细胞(P1)和软骨前体细胞(P2)组成.P1细胞占大多数(69.4％),呈纤维状;P2细胞为少数(11.0％),呈椭圆状.与CD44和CD90结合分析表明,P1细胞几乎不能与CD44结合,绝大部分P2细胞能与CD44结合,P1和P2细胞均能与CD90相结合,P2细胞结合能力略强于P1细胞.分别对两类细胞进行细胞凋亡分析后发现,P1细胞体外培养只有少量细胞凋亡或坏死,活细胞率达(96.61±1.32)％,说明P1细胞在体外传代过程中能维持稳定状态;P2细胞处于晚期凋亡和坏死细胞的比例＞83％,说明P2细胞在体外培养条件下细胞状态不稳定.本研究结果表明,体外建立一套针对于软骨前体细胞培养的体系很有必要,以保证软骨前体细胞可以持续增殖、并可向软骨细胞转化.本研究为今后以猪耳廓作为模型开展人类弹性软骨再生医学研究提供了基础依据.     

小麦TaFKBP62c-2B基因克隆、组织表达及亚细胞定位

FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-proly cistrans isomerase,PPIase)活性,可以作为一种分子伴侣在蛋白折叠中发挥作用.本研究采用同源基因克隆获得小麦(Triticum aestivum)高温胁迫应答基因TaFKBP62c-2B,利用qRT-PCR和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)示踪技术明确了TaFKBP62c-2B的表达模式和亚细胞定位信息.序列分析结果表明,小麦TaFKBP62c-2B基因含有37 bp的5'UTR区、1 926 bp的完整CDS以及176 bp的3'UTR区,共编码642个氨基酸(GenBank登录号:KU350629).结构域分析发现,TaFKBP62c-2B是由3个FK506结合保守域(FKBP_C)和3个三十四肽重复序列(tetratricopeptide repeat,TPR)构成的多域FKBP.qRT-PCR结果显不,TaFKBP62c-2B强烈响应高温胁迫;组织表达分析表明,TaFKBP62c-2B主要在小麦的茎和小穗等植株地上组织中表达,在根部的表达量较低.亚细胞定位表明,TaFKBP62c-2B位于内质网上.本研究获得了小麦TaFKBP62c-2B基因全长、明确了其表达规律以及亚细胞定位信息,为进一步了解TaFKBP62c-2B的生物学功能提供了基础资料.     

大菱鲆心脏细胞系的建立与鉴定

为丰富海水鱼类细胞系的数量,提供更多的基因功能研究及病毒分离、鉴定工具,本研究建立了一种新的细胞系,大菱鲆心脏细胞系(Scophthalmus maximus heart cell line,SMH).该细胞系使用组织块法(tissue block method)启动原代培养,培养液是添加了胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、人类碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、抗生素、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)的DMEM/F 12.结果显示,SMH形态呈典型的成纤维细胞样,在培养液中生长分裂旺盛,经230 d传代培养,成功传至58代.用带有绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)的pEGFP-N3质粒转染SMH,发现GFP在细胞中成功表达,转染效率为40％左右.使用遗传霉素(geneticin,G418)对重组质粒细胞进行筛选,得到了一簇荧光表达效率高的细胞.染色体分析表明,具有正常二倍体核型(2n=44)的细胞占64％.线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase sub-unit Ⅰ,CO Ⅰ)基因鉴定出该细胞系来源于大菱鲆.该细胞系的建立为大菱鲆功能基因及其他基于细胞系的研究奠定了基础,对大菱鲆的病毒感染途径和分子机制研究具有重要的理论意义.     

钌配合物[Ru(MeIm)4(4mopip]2+急定G-四链体对抑制肺癌细胞生长机制的研究

制备一种新型钌配合物[Ru(MeI m)_4(4mopip)]~(2+)(RuM e Mo),运用元素分析(C、H、N)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、核磁共振谱(~1H NMR)对Ru Me Mo进行了结构表征。紫外光谱、热变性试验和圆二色光谱研究RuM e Mo与F21T的分子作用机制,发现其能诱导线性G-四链体DNA形成混合型结构并能有效稳定G-四链体。MTT法评估RuM e Mo对癌细胞的抑制作用及其对正常细胞的毒性,发现其对肺癌细胞(A549)表现出高选择的抑制作用,而对正常人类肺原胚细胞(CDDP)则表现出较低的细胞毒性。本研究结果表明,RuM e Mo因其稳定G-四链体DNA的能力,从而有被运用于肺癌治疗的潜质。     

湖北省楠木属植物童期幼茎形态比较研究

以紫楠（Phoebe sheareri）、浙江楠（P. chekiangensis）、闽楠（P. bournei）、楠木（P. zhennan）、白楠（P. neurantha）、山楠（P. chinensis）为试材,对6种楠木属植物的幼茎及表皮细胞进行了比较研究。结果表明,紫楠幼茎密生锈色被毛,圆柱形,接近顶芽位置呈扁平状,表皮细胞形状相似,不规则,分布杂乱;浙江楠幼茎有白色被毛,少量斑点,表皮颜色较绿,侧枝部位扁平状,表皮细胞分布整齐,形状规则,近矩形;闽楠幼茎表皮无被毛,光滑,颜色绿紫,似圆锥形,较细,表皮细胞大,分布整齐,形状各异;楠木幼茎表皮无被毛,有白色附属物,扁平状,有菱有凹,有不规则形状的红色斑点,表皮细胞小,杂乱不规则;白楠幼茎表皮无被毛,近圆柱形,有凹痕,颜色较绿,紫色斑点较多且向外凸出,幼茎表皮细胞间隙大,分布较乱;山楠幼茎表皮无被毛,光滑,有菱又有凹痕,大量的红色斑点,斑点呈长条状,表皮细胞分布均匀,大小相近,较密。该结果可以用于对6种楠木属植物进行童期鉴定。