基于重组酶聚合酶扩增技术的玉米矮花叶病毒快速检测方法的建立

玉米Zea mays L.是重要的粮饲兼用作物。重要检疫性病毒玉米矮花叶病毒maize dwarf mosaic virus(MDMV)一直威胁玉米生产,为预防外来有害生物入侵,本研究以玉米可能携带的MDMV为目标,根据MDMV外壳蛋白(coat protein,CP)保守基因序列,基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),设计了3对RPA引物,筛选并优化了反应体系,建立了MDMV的快速检测方法,最终的RPA反应体系中引物终浓度为0.4 μmol/L,反应温度为42℃,反应时间为20 min。该方法可特异性检测MDMV,对MDMV CP阳性质粒样品的检测灵敏度可以达到105拷贝/μL(≈369 fg/μL),高于RT-PCR的检测灵敏度。该方法具有快速准确等优点,可用于玉米种子或植株中携带MDMV的检测。     

芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA）检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。     

桑椹菌核病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

为及时高效地鉴别桑椹菌核病的病原菌桑实杯盘菌Ciboria shiraiana和肉阜状杯盘菌C. carunculoides,根据RPB2基因序列设计引物并验证其特异性,建立这2种病原菌的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)检测体系,运用该体系对抗、感果桑品种不同时间点芽(果)内的2种病原菌进行检测。结果表明,设计的2对引物特异性强,qPCR检测灵敏度均为10^-4ng/μL,均为常规PCR灵敏度的10~5倍,建立的桑实杯盘菌和肉阜状杯盘菌qPCR标准曲线的扩增效率分别为104.89%和95.30%。利用所建方法成功从采集的果桑样品中检测出病原菌主要为肉阜状杯盘菌,且感病品种中肉阜状杯盘菌的含量随着时间不断增加,在将要显症时激增。表明所建qPCR体系适用于桑椹菌核病早期无症状芽(果)的检测,可通过监测其病原菌类型和含量为该病害的预测预报及早期防治提供依据。     

江苏玉米粗缩病病原病毒的RT—PCR检测

玉米粗缩病毒和水稻黑条矮缩病毒均可由灰飞虱传播并侵染玉米使其发生粗缩病。两种病毒相似之处较多,常规方法很难区分。本研究根据以往已发表的这两种病毒的核酸序列,分别合成了两病毒的特异引物,利用一步法反转录－聚合酶链式反应（ＴＲ－ＰＣＲ）建立了玉米粗缩病病原病毒的快速检测和诊断的方法。对江苏省盐城地区田间自然感病玉米的ＲＴ－ＰＣＲ检测结果和扩增片段序列分析表明：在该地区玉米粗缩病病样中只检测到水稻黑条矮     

以冻融法快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli DH5α菌株，IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶，利用该酶的热稳定性，反复2次－70℃，75℃交替冻融以裂解细胞释放胞浆；以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的。PCR扩增反应和SDS－PAGE分析表明所制备的Tap DNA聚合酶的纯度，活力，敏感性，特异性均达到试验要求。该方法具有快速简便的优点。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在牛病原检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术,它不同于传统的PCR扩增,可在恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增,具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点,具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、引物设计与反应条件、产物检测方式及在牛病原检测中的应用等内容,旨在为牛病原检测新技术、新方法的研制提供参考。     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的Ｓｍａ Ｉ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％，编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍ     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。     

猪瘟病毒4种检测方法的比较

应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法,分别对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒(CSFV)进行了检测,并比较4种检测方法的优缺点。结果显示,病毒分离鉴定法准确性较高,诊断比较容易,但存在试验步骤繁琐,所需时间长的缺点;荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,特异性比较差;RT-PCR检测法具有快速、敏感等优点,特别是样品保存不理想时更有价值,利用套式PCR(nested-PCR)可以提高检测的特异性;夹心ELISA检测法具有快速、敏感等优点,但在样品保存不理想时会出现假阴性结果。     

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp epf ) ,1株为 mrp epf- ,1株为 mrp- epf- 。