一种应用LORF11同源子鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法

为建立一种鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法,根据已发表的8株鸭瘟病毒株的长区开放阅读框(LORF11)等位基因序列,在其开放阅读框等位基因的上游5 bp和下游101 bp的位置设计1对特异性引物。应用这对引物对鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株DNA进行PCR扩增,分别获得了4 448 bp、3 277bp、934 bp和2 518 bp的特异性条带。此PCR方法特异性强,敏感性高,可检测到10TCID50或0.1LD50的鸭瘟病毒。在感染鸭瘟病毒的组织(肝脏)中均能检测到鸭瘟病毒DNA。对疑似鸭瘟的临床病料的检测结果也证明,建立的PCR方法不仅能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒,而且能鉴别感染的鸭瘟病毒的来源。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

鳜鱼病毒传播途径的初步研究

采用PCR方法,追踪养殖鳜的亲鱼、子代、饵料鱼及与鳜养殖环境相关的水体生物和非生物因子中鳜鱼病毒的存在状况,并探讨鳜鱼病毒的传播途径。本研究中,鳜鱼塘水体中采集的除鳜以外的其他生物、底泥及水样的核酸抽提样本PCR扩增病毒结果呈阴性;感染病毒的亲鱼,其性腺中可检测出病毒,其子代组织病毒检测亦呈阳性。研究获得病毒可以在鳜体内呈潜伏状态存在和病毒可以垂直传播的一些证据。     

现代生物技术检测对虾病毒病在商业化应用中的限制

对虾病毒性疾病有多种，如白斑病毒、桃拉病毒、黄头病毒等。多年来，科研人员对病毒病的诊断方法进行了大量的研究，现代生物检测技术得到较多应用，如酶联免疫吸附（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针斑点杂交等，发表了较多提取病毒、改进病毒检测方法等文章。检测方法越来越简易、灵敏，并开发有WSSV、TSV等病毒检测试剂盒。利用现代生物检测技术诊断对虾病毒病对监测养殖生产中的疾病流行趋势有一定的作用，但各种检测方法大都局限于国家机构的实验室进行，难以大规模商业化应用。是什么原因使先进的检测技术无法服务于养殖生产？现结合生产以及科研实践进行多方面探讨，供参考。     

对虾WSSV和IHHNV多重PCR检测试剂盒的研究与应用

在对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)二温式PCR检测技术前期研究的基础上,将这2种病原的特异性引物与PCR基础反应液一起组装成快速检测试剂盒。通过对试剂盒敏感性、稳定性和保存期等技术指标的测定以及对临床样品的检测试验,该试剂盒对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板均能特异性地扩增出2条与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)的DNA片段,而对其它对虾病原的扩增结果均为阴性;该试剂盒最低能检测到102pg的WSSV DNA和10 pg的IHHNV DNA。对WSSV和IHHNV DNA的检出量分别为102~103pg和10~102pg。     

用PCR法快速筛选中国对虾含微卫星的重组阳性克隆

运用PCR在中国对虾的小片段基因组文库中快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆。PCR中使用的引物为载体pGEM-3(zf( )上多克隆位点两侧的T7／Sp6启动子引物和根据微卫星核心重复序列设计的STR引物：STR1：5‘-ATATATATATAT－3‘：STR2：5’－TCTCTCTCTCTC－3’，直接使用含有重组克隆的菌液，在PCR反应前增加一段裂解细菌的高温。筛选出来的含有微卫星序列的重组阳性克隆经DNA测序验证。结果证明，采用PCR方法用菌液快速筛选含有微卫星序列的重组阳性克隆完全可行，而且具有简便、快速、高效、不涉及同位素操作等优点。     

用逆转录多聚酶链式反应从凡纳对虾中检出传染性皮下组织和造血器官坏死病毒

传染性皮下组织和造血器官坏死病毒 (ＩＨＨＮＶ) ,是一种细小病毒 ,它能感染所有起源于中胚层和外胚层的对虾组织细胞[1] 。在许多养殖对虾的国家都有ＩＨＨＮＶ ,特别是中美洲国家和地区[2 ] 的对虾养殖业深受其害。随着各国间对虾贸易的急剧增长 ,ＩＨＨＮＶ地理分布范围日益广泛 ,迄今为止 ,已扩散到中国台湾、新加坡、马来西亚、泰国、印度尼西亚、澳大利亚、菲律宾、厄瓜多尔、秘鲁等国家和地区[2 -4] 。红额角对虾 (Ｐｅｎａｅｕｓｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒｉｓ)、斑节对虾 (Ｐ .ｍｏｎｏｄｏｎ)、短沟对虾 (Ｐ .ｓｅｍｉｓｕｌｃａｔｕ…     

Differential Responses of Nitrifier and Denitrifier to Dicyandiamide in Short- and Long-Term Intensive Vegetable Cultivation Soils

Nitrification inhibitors, such as dicyandiamide （DCD）, have been shown to decrease leaching from urea- and ammoniumbased fertilizers in agricultural soils. The effect of nitrification inhibitors on nitrifier and denitrifier in short- and long-term intensive vegetable cultivation soils was poorly understood. In this study, the pot trial was conducted to investigate the differential responses of nitrifier （amoA-containing bacteria） and denitrifier （nirK-containing bacteria） to DCD in short-（soil S） and long-term （soil L） intensive vegetable cultivation soils. Quantitative polymerase chain reaction （qPCR） and terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP） were employed to detect the abundance and composition of amoA- and nirK-containing communities. The results indicated that application of DCD led to a consistently higher NH4＋-N concentration during the whole incubation in soil L, while it was quickly decreased in soil S after 21 days. Furthermore, DCD induced more severe decrease of the abundance of amoA-containing bacteria in soil L than in soil S. However, the abundance of the nirK- containing community was not significantly affected by DCD in both soils. Long-term vegetable cultivation resulted in a super-dominant amoA-containing bacteria group and less divergence in soil L compared with soil S, and DCD did not cause obvious shifts of the composition of ammonia-oxidising bacteria （AOB）. On the contrary, both amoA- and nirK-containing bacterial compositions were influenced by DCD in soil S. The results suggested that long-term intensive vegetable cultivation with heavy nitrogen fertilization resulted in significant shifts of AOB community, and this community was sensitive to DCD, but denitrifiers were not clearly affected by DCD.     

应用实时荧光定量PCR相对定量法检测毛皮动物细小病毒载量

参考GenBank中已登录的CPV-SC-JM VP2基因序列设计引物,选用β-actin作为内参基因,利用SYBR GreenⅠ实时定量PCR相对定量法,对规模化毛皮动物场的12份粪便样品和5份血液样品进行检测。常规PCR方法检出14份,检出率82%,荧光定量PCR相对定量方法检出17份,检出率100%;粪便中病毒含量明显高于血液中病毒含量,最高可达7000倍;不同毛皮动物粪便样品中病毒含量也存在较大差异。     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.