荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立

[目的]建立荧光定量PCR检测猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor,EF)3种主要毒力因子的方法。[方法]根据cps2j、mrp和ef基因的基因序列,分别设计并合成3对引物及相应的Taqman探针,其中cps2j和mrp的5'端标记FAM荧光发射基团,ef的5'端标记HEX荧光发射基团,3种基因的3'端都标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的荧光定量PCR方法检测上述3种主要毒力因子,其中cps2j单独检测,mrp与ef的实行双重荧光PCR方法检测。[结果]cps2j、mrp和ef的最低检测限分别为12、51和51 CFU,灵敏度很高;与其他病原菌无交叉反应,重复性及特异性均较好;此外,整个检测过程在60 min内即可完成。[结论]该试验所建立的双重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型3种主要毒力因子。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子

根据猪链球菌基因序列,设计合成10对引物,通过在3个反应体系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的组合优化,建立涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的快速敏感的多重PCR检测方法.对不同菌株检测结果显示,该多重PCR方法特异性强、敏感性高,能快速检测出猪链球菌2、7、9型及其毒力因子表型,可用于快速诊断及猪链球菌的分子流行病学调查.     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+/GDH+,30%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH-,10%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH+。【结论】CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋/GDH＋,30%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH-,10%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH＋。【结论】CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征

为了研究国内致病性猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的毒力因子分布特征,本试验选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2,设计并合成7对引物,用PCR方法进行检测。结果显示:25株猪链球菌2型(SS2)国内分离株,96%(24/25)表现为cps /gdh /epf /mrp /sly /fbps /orf2 ,仅1株表现为cps /gdh /epf-/mrp /sly /fbps /orf2 ;1株猪链球菌1型(SS1),表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;1株猪链球菌7型(SS7)国内分离株,表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;2株猪链球菌9型(SS9)国内分离株,均表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2 ,可见国内SS2的毒力基因分布特征与欧美等国家明显不同,提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。     

猪链球菌2型病的研究现状及防治措施

猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原,对猪链球菌2型的流行病学、毒力因子、检测方法和疾病防治等方面进行了综述。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

1株猪链球菌的分离·鉴定及其毒力因子研究

[目的]对1株疑似猪链球菌菌株进行鉴定,为进一步研究猪链球菌的毒力提供理论基础。[方法]采用革兰氏染色镜检、形态观察和16S rDNA测序后NCBI数据库Blast比对鉴定菌株;另外选取猪链球菌7种主要毒力因子设计引物,利用PCR方法检测其毒力基因分布情况。[结果]显微镜下该疑似菌株为革兰氏阳性菌,多数呈链状,少见单个排列。16S rDNA测序结果与猪链球菌2型同源性达到99%。毒力因子检测均含有7种毒力因子。[结论]该疑似菌株为猪链球菌2型,其毒力基因型为：gdh＋/ef＋/mrp＋/sly＋/fbps＋/orf2＋/cps2J＋/。     

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌2型分离株HA9801的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF），制备其抗体。用此抗体建立了Dot-ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35246和HA9801为阴性和阳性对照，检测17株猪源链球菌和1株猪链球菌2型人分离株。结果显示，两种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61％（11／18）。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。     

荧光定量PCR检测猪肝中猪链球菌2型的基因组DNA提取方法的比较

[目的]在人工布菌猪肝中评估溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法提取猪链球菌2型基因组DNA在荧光定量检测中的应用效果,为猪链球菌2型的荧光定量检测选择合理的基因组DNA提取方法提供试验依据。[方法]采用溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法分别提取人工布菌猪肝样本中猪链球菌2型基因组DNA,通过荧光定量PCR技术检测猪链球菌2型的相对含量。[结果]利用荧光定量方法能够检测到猪链球菌2型。该方法可以最低检测到12 CFU/g的猪链球菌,特异性良好,标准曲线方程为y=-3.185 9x+39.901 0。在人工布菌猪肝样本中,溶菌酶-苯酚法在q PCR实验中检测猪链球菌2型较灵敏。[结论]溶菌酶-苯酚法在猪肝样品中提取基因组DNA效果较好;试剂盒法在细菌纯培养物中提取基因组DNA具有安全、高效等优点。     

猪链球菌及其血清型的PCR检测

从广东省部分地区猪场采集疑似猪链球菌病病猪的扁桃体棉拭病料202份,用PCR方法检测棉拭样本培养物中猪链球菌（Streptococcussuis）及其主要致病血清型（1、2、7和9型）．检出阳性样品147份,检出率为72．8％．其中检出S．suis血清2型21份,检出率为12．9％;检出血清9型6份,检出率为3．0％;未检出血清7型和1型．此外,不同地区和不同发育阶段的猪,S．suis检出率和各血清型检出情况也存在较大差异．从而证实广东地区猪群中广泛存在S．suis呈地域性流行,并且是多种血清型共存．     

猪链球菌2型福建株的分离鉴定

从临床表现为败血症的濒死病猪肝脏、肺脏、淋巴结中分离到一株链球菌,进行形态学、生化特性、小白鼠感染试验及PCR鉴定和CPS2 J序列测定.结果表明:该分离菌的形态、培养和生化特性基本符合链球菌的特点;人工感染试验显示,小白鼠腹腔接种0.2 mL分离菌培养物不发病,但接种1 mL能在48 h内致小白鼠死亡,并能从脏器中分离到接种菌;分离菌的PCR扩增产物与猪链球菌2型阳性参考菌株JA070109大小一致、长度为675 bp的特异性条带,其PCR产物的核苷酸序列与GeneBank上公布的猪链球菌2型不同菌株的同源性高达98%-100%.可见,该分离菌为猪链球菌2型,并首次证实福建存在猪链球菌2型.     

用PCR和ELISA方法分析奶牛血清和奶中类乙型肝炎病毒

用人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）ＥＬＩＳＡ试剂盒检测８５份奶牛血清和９３份奶样。结果测出３３份血清为ＨＢｓＡｇ阳性，其中４价亦为ＨＢｅＡｇ阳性；２２份奶样为ＨＢｓＡｇ阳性，其中１１份亦为ＨＢｓＡｇ阳性。７个双阳性的样本，用针对ＨＢＶ表面抗原基因不同部位的两对引物作ＰＣＲ分析，结果未能扩增出特异片段，排除了奶牛ＨＢＶ血清学阳性是由人ＨＢＶ感染所致。