奶牛乳腺上皮细胞的体外培养及蛋白含量测定

为建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系(BMEC),进一步研究乳腺上皮细胞体外蛋白的分泌情况,本试验首先采用组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,用胰蛋白酶纯化细胞,并运用SDS-PAGE进行鉴定。采用MTT分析细胞活力,瑞氏-吉姆萨染色法对细胞核进行分析,并测定细胞上清液中β-酪蛋白(β-CN)含量。结果显示:本试验成功培养出较纯化的奶牛乳腺上皮细胞;细胞生长曲线呈明显"S"型,用瑞氏-吉姆萨法染色细胞,细胞核形态多为卵圆形且呈现明显蓝紫色。原代乳腺上皮细胞可连续多次传代且未出现永生化,细胞呈单层贴壁生长,证明细胞活力良好;测定其β-CN含量为3.3 mg/L。     

碱溶pH对曲拉酪蛋白结构的影响

以圆二色谱、荧光光谱、浊度、激光粒径等测试手段,研究了经不同pH碱溶处理的牦牛乳曲拉酪蛋白结构的变化.牦牛乳曲拉经pH 6.0～12.0碱溶,等电点沉淀所得酪蛋白湿凝块在pH 7.0磷酸盐缓冲溶液中溶解形成酪蛋白胶束溶液,进行酪蛋白结构测定.结果表明:随碱溶的pH增加,酪蛋白分子的二级结构发生了明显变化,其β-折叠含量先增后降,α-螺旋含量先降后增,疏水性降低,与此同时伴随着酪蛋白粒径的增加、酪蛋白体系浊度降低.碱溶曲拉酪蛋白分子间的疏水作用和静电相互作用在胶束的二次形成过程中起到了重要作用.     

金银花水提取物对山羊乳腺上皮细胞增殖及β 酪蛋白表达的影响

采用MTT比色法、Western blotting和实时荧光定量PCR,检测不同质量浓度金银花水提取物对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖活性和泌乳能力的影响。结果表明,培养液中金银花水提取物为1 000 mg/L时,对体外培养的山羊乳腺上皮细胞有明显促增殖作用（P<0.01）;培养液中金银花水提取物为1 000、500 mg/L时,β 酪蛋白的表达量极显著高于对照组。可见：1 000 mg/L金银花水提取物能促进山羊乳腺上皮细胞增殖并提高泌乳能力。     

酪蛋白源阿片物质的分离、纯化及活性鉴定

酪蛋白的胃蛋白酶水解物通过RP-HPLC进行分离,并用NG108-15 细胞对其进行阿片样活性鉴定。实验结果表明:酪蛋白经胃蛋白酶处理2 h 后, 其酶解产物中有阿片样活性物质产生, 而酪蛋白本身无阿片活性。     

牛乳β-酪蛋白检测的ELISA方法

体外乳腺细胞培养是整体泌乳研究的有效补充,也在乳腺生物反应器的研究中发挥着重要作用.但乳腺细胞分离培养成功的标志不仅仅是细胞的形态特征及增殖特性,更重要的是细胞的生理功能及分化状态.β-酪蛋白为乳中所特有的蛋白质,其在乳中的含量仅次于α-S1酪蛋白居第二位,故可用这种蛋白做为乳腺细胞分化功能的指标.     

牛乳β-酪蛋自检测的ELISA方法

体外乳腺细胞培养是整体泌乳研究的有效补充,也在乳腺生物反应器的研究中发挥着重要作用。但乳腺细胞分离培养成功的标志不仅仅是细胞的形态特征及增殖特性,更重要的是细胞的生理功能及分化状态。卜酪蛋白为乳中所特有的蛋白质,其在乳中的含量仅次于ａ一马酪蛋白居第二位,故可用这种蛋白做为乳腺细胞分化功能的指标。（①闷ｐ出ｌｉｎｋａｌ;;ｍｌｎ～ｍｐ）方法是以胡作为标记物或指示剂,进行抗原或抗体的检测。与放射免疫法比较。具有所需仪器设备简单、试剂价廉、无放射性危害等优点。９－＄蛋白的ＥＩＪＳＡ检测国内未见文献报道,…     

D101树脂固定中性蛋白酶的条件优化及酶学性质研究

【目的】提高中性蛋白酶的固定化效果,对D101树脂固定中性蛋白酶的条件进行优化并对固定化酶的酶学性质进行研究。【方法】以D101树脂吸附法固定中性蛋白酶,分别测定不同温度、时间和加酶量条件下固定化酶的固定化效果,并对固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的酶学性质进行比较研究。【结果】D101树脂固定中性蛋白酶的最佳固定条件为:加酶量150 U/g,温度40℃,固定时间120 min,此时固定化酶的酶活回收率最高(70%)。固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的最适温度分别为46和40℃,最适pH值分别为7.4和7.2,表观米氏常数Km分别为0.22和0.20 mg/mL,最大酶促反应速度Vmax分别为0.39和0.21 mL/min。【结论】以D101树脂固定中性蛋白酶后,固定化中性蛋白酶的活力、酶活回收率以及热稳定性和pH稳定性显著提高。     

酪蛋白酶解产物β-酪啡肽-7的 HPLC分析和阿片活性鉴定

利用建立的高效液相色谱(HPLC)定量分析法, 在酪蛋白2 h酶解液中检测到134.27 μg·mL-1的β-酪啡肽-7(β-CM-7); 其酶解消化液经葡聚糖凝胶柱层析收集物3、4组中也检测到β-CM-7, 含量分别为44.79和18.90 μg·mL-1;而1和2组中未检测到.细胞生物学鉴定结果表明 酪蛋白酶解液、柱层析收集的3、 4组均能抑制富含δ-阿片受体的神经杂交瘤细胞腺苷酸环化酶活性, 降低细胞内cAMP水平, 纳洛酮可逆转这种抑制作用, 证明有阿片活性. 1、 2组和酪蛋白本身无阿片作用. HPLC测定结果与细胞生物学鉴定结果相符, 证明所建立的HPLC方法可用于酪啡肽的定量分析.     

牛乳中乳源糖巨肽及β-酪蛋白的分离纯化

[目的]通过凝乳酶酶解牛乳得到乳源糖巨肽（CGMP）,利用CGMP对三氯乙酸的耐受差异,实现CGMP的分离与纯化。利用β-酪蛋白在低温低酸条件下容易游离的特性,从凝乳酶酶解后的酪蛋白中分离出β-酪蛋白。[方法]鲜牛乳经过脱脂后,加入适量凝乳酶在35℃条件下充分酶解,酶解后样品离心后得到上清液和沉淀。在上清液中加入三氯乙酸实现CGMP的除杂和沉淀,得到固体CGMP采用高效液相色谱仪测定其纯度;沉淀经过碱性复溶降低温度后,在全程低温条件下调节pH值到3.5,低温离心取上层清液,升温至35℃,再次常温离心后得到β-酪蛋白,并用高效液相色谱仪测定其纯度。[结果]当TCA浓度达到10%时,溶液中CGMP全部析出。收集分离纯化后的CGMP固体,经高效液相色谱法检测,CGMP纯度为80%～90%。在低温低酸性条件下,分离得到纯度较高的β-酪蛋白,纯度为85%～90%。     

龙眼胚性愈伤组织DlCK2-α基因克隆、亚细胞定位及其表达特性分析

【目的】克隆龙眼DlCK2-α基因,并对其表达特性进行分析。【方法】该试验通过RACE技术对DlCK2-α进行克隆,并在此基础上进行生物信息学分析和亚细胞定位以及蛋白质结构和功能的预测。对调控DlCK2-α的miRNA及顺式作用元件进行预测,并进行亚细胞定位观察。采用QRT-PCR技术对其在龙眼体胚不同阶段胚性培养物和不同光质的表达特性进行研究。【结果】DlCK2-α基因含有开放阅读框1 002 bp,共编码333个氨基酸(GenBank登录号:MG181952);DlCK2-α属亲水性蛋白,不含有信号肽和跨膜结构域,但是含有一个典型的STKc_CK2_alpha保守结构域,预测含有32个磷酸化位点;miRNA预测结果显示,共有miR2615a等10条miRNA可能调控DlCK2-α;顺式作用元件预测显示多个光响应与应激响应元件可能调控DlCK2-α;GFP荧光定位观察显示其定位于细胞质。QRT-PCR结果显示,DlCK2-α在黑暗条件下的表达量高于光处理下的表达量。在体胚不同发育阶段,DlCK2-α在不完全胚性紧实结构中的表达量最低,球形胚中表达量最高,整体呈先降后升趋势。【结论】DlCK2-α基因在龙眼光信号转导和体胚发育调控中发挥重要作用。