牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。     

不同株鸡新城疫病毒结构蛋白的比较研究

对鸡新城疫病毒(NDV)B1株、La Sota株、Mukteswar株和长春强毒野毒株(C87E7)感染的鸡胚尿囊液分别进行浓缩和提纯,并作SDS-PAGE和Western印迹,进行结构蛋白及其抗原性的分析。结果,4株NDV的电泳图谱显示11-12条结构蛋白带,分子量从43000到120000不等。其中各株均有3条主要蛋白带,8～9条次要蛋白带。不同株NDV的次要蛋白带有明显的区别。Schiff氏试剂染色证明,分子量为76000、52000和50000的蛋白为糖蛋白。结构蛋白的抗原性分析表明,4株NDV蛋白带中有2条具有共同抗原性,其他蛋白带的抗原性则有差异或明显不同。     

质粒DNA拓扑学结构对基因疫苗生物学特性的影响

利用不同拓扑学结构的质粒 ,分别转化 E.coli感受态细胞、转染 SK6 - 6细胞和免疫小鼠 ,比较了不同拓扑学结构质粒对转化效率、转染率和对免疫应答水平的影响。结果显示 ,超螺旋占 5 0 %比例的猪瘟病毒 E2基因表达质粒p CDSW转化 E.coli感受态细胞的效率比开环的 p CDSW高 8倍 ,超螺旋比例占 80 %的 p VAXE2 IL- 2质粒比酶切线性化质粒转化率高 2 2倍 ;以荧光蛋白基因为报告基因 ,超螺旋比例占 80 %的荧光蛋白真核表达质粒转染真核细胞的效率是线性化质粒的 12倍 ;以猪瘟病毒主要保护性抗原 E2基因表达质粒 ,分别制备成超螺旋和开环形式占优势的质粒 ,免疫昆明鼠 ,抗体检测结果显示 ,超螺旋比例高的基因疫苗免疫效果明显好于开环质粒的基因疫苗     

犬细小病毒基因型的调查

采用 PCR方法扩增了 13株犬细小病毒 ( canine parvovirus,CPV) VP2基因的 2个片段 ,通过序列测定和 DNAS-tar软件分析 ,结果显示 ,我国的 CPV分离株也存在基因变异现象 ,除发现 CPV- 2、CPV - 2 a、CPV- 2 b突变株外 ,还发现在 CPV- 2 a基础上进一步进化产生的 2个新的变异株。在我国 ,CPV- 2曾在 2 0世纪 80年代早期流行 ,但 1986年后分离到的 CPV以 CPV- 2 a为主 ,在 2 0 0 2年送检的 8份病料中分离到 4株 CPV- 2 a和 4株 CPV- 2 b。PV/貉 / CC/ 1/ 86在CPV- 2 a的基础上 VP2发生氨基酸 30 0 G→ S替换 ,PV/犬 / JL / 1/ 0 2在 CPV- 2 a的基础上 VP2发生氨基酸 5 6 4 S→ N替换 ,其确切的生物学意义尚不清楚。我国的 CPV分离株与参考毒株的核酸同源性超过 98% ,没有形成明显的中国CPV分支 ,进化方式与文献报道的进化方式一致     

狂犬病病毒糖蛋白转基因小鼠对该病毒形成免疫耐受

对带有绵羊ＭＴ启动子－狂犬病病毒糖蛋白基因的（ＭＴ－Ｒｇｐ）的ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）２Ｌｇｅ、ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）４Ｌｇｅ和ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）６Ｌｇｅ３株转基因小鼠系（子代）进行了表达检测。ＥＬＩＳＡ结果表明，小鼠肝脏、肾脏中均有糖蛋白表达产物，以肝脏的表达量较高；对肝脏的免疫组化检测结果显示，糖蛋白分布在肝脏实质细胞，主要位于细胞膜上和胞浆内。对８只ＴｇＮ（ｏＭＴ－Ｒｇｐ）２Ｌｇｅ子代鼠一次接种灭活的狂犬病病毒８２０２株，接种前和接种后３周的血清抗体水平变化在转基因鼠和非转基因鼠之间有明显区别，非转基因鼠抗狂犬病病毒抗体水平明显升高，而转基因鼠抗体水平基本保持不变。经统计学分析，转基因鼠的抗体水平变化相差不显著，表明转基因小鼠对该病毒形成了部分免疫耐受性。     

狂犬病发病机理的研究进展

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种重要的人兽共患传染病,在人主要表现为急性、几乎不可逆转的脑脊髓炎,目前没有有效的治疗方法,病死率几乎100%。目前对狂犬病病毒感染和狂犬病发病机理的认识还很不透彻,但近年来的研究也取得了不少进展,主要涉及狂犬病病毒受体、神经细胞功能失调的原因和神经细胞凋亡机制、狂犬病病毒与机体免疫系统相互作用机制,狂暴型和麻痹型狂犬病的发病机制,这些都将为狂犬病的治疗研究起到推动作用。     

猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pVTSOL18m的构建

根据Kozak原理设计引物，以重组原核表达载体pGEX—TSOL18为模板扩增TSOL18基因，用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后与经相同处理的pVAX1载体连接并转化JM109感受态细胞，经测序证明读码框正确后，再根据PCR点突变的方法设计引物。将目的基因NruⅠ位点中的碱基（第347位）经三次PCR反应突变，最终获得含突变位点的TSOL18m基因。EcoRI、XhoI再次酶切后与pVAX1载体连接，成功构建了含点突变的重组pVAX1表达载体，为TSOL18基因重组犬2型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

Tn5转座子介导表达猪瘟E2蛋白和EGFP重组伪狂犬病毒的构建

为构建猪瘟重组伪狂犬疫苗,以Tn5转座子为介导,采用体外转座的方法将猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）E2基因和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluoresce protein,EGFP）的表达盒随机插入伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）基因组中,随后将转座产物转染BHK-21细胞,获得表达E2蛋白和EGFP的病毒库,并对E2蛋白和EGFP在细胞上的表达效果进行PCR鉴定和间接免疫荧光分析。试验结果表明,运用体外转座的方法可以将外源基因插入PRV基因组中,并且外源基因可以在细胞中表达。本研究为重组病毒的研究提供了新思路,并为新型重组猪瘟疫苗的研制进一步奠定了基础。