鸭胚骨骼肌成肌细胞中MyoD1和Myf5基因的表达与分析

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚（13、15、17、19、21和23胚龄）骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和尬庐基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异．结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律：胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈“低→高→低→较高”的趋势,类似反“-”形;MyoD1基因的表达呈“低-高-低”的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降（P〈0．01）,并维持在低水平,类似“∧”形,而在高邮鸭17胚龄时达到高峰后维持高水平至19胚龄（P〉0．05）,再下降并维持在低水平（P〈0．05）,类似“∩”形．腿肌成肌细胞中,岣筘基因的表达呈“低-高-低”的趋势,类似“∧”形;MyoD1基因的表达呈“较高→低→高→低”的趋势,类似“－”形．结果提示：Myf5和MyoD1基因在骨骼肌成肌细胞中的表达具有时间和品种依赖性;两基因在两品种鸭胸腿肌中均在17胚龄时达到高峰,表明17胚龄可能是成肌细胞分化和增殖的一个重要时期．     

不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达差异分析

为探讨生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）和胰岛素样生长因子 1（Insulin like growth factor 1,IGF 1）在不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达差异。选择生长速度不同的金定鸭和高邮鸭为试验动物,采用实时荧光定量PCR方法检测鸭13,15,17,19,21和23胚龄时胸肌和腿肌成肌细胞GHR,IGF 1 mRNA的表达情况,并进行了品种间比较。结果发现：13胚龄时,高邮鸭胸肌和腿肌成肌细胞IGF 1的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）;17胚龄是两个品种鸭GHR和IGF 1共同的表达高峰期;17胚龄之后,鸭胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达均显著降低。在19,21胚龄时,高邮鸭胸肌成肌细胞2个基因的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）,而腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达在品种间无显著差异（P>0.05）。鸭胚胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达呈现极显著的正线性相关（P<0.01）。提示：GHR和IGF 1的表达谱及各自在品种间的变化规律基本一致;鸭胚骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达有组织特异性,二者之间可能存在正调控的作用机制。     

circRIPK2在鸡骨骼肌细胞增殖分化中的调控作用

目的 探索circRIPK2在鸡骨骼肌生长发育中的功能及作用机制。方法 依据反向剪切位点设计收敛、发散引物,并结合Sanger测序验证circRIPK2的环形结构。利用RT-PCR探究不同发育时期circRIPK2的表达水平。通过构建过表达载体,结合EdU、流式细胞术和RT-PCR,探究circRIPK2对鸡原代成肌细胞增殖分化的影响。结果 PCR电泳结果及Sanger测序证明circRIPK2环化位点真实存在。RT-PCR结果表明,和对照组相比,过表达circRIPK2后,对细胞增殖有抑制作用的标记基因p21的mRNA表达上调20%,对细胞增殖有促进作用的标记基因Cyclin B2、Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的mRNA表达分别下调39%、22%、29%和45%;肌分化标记基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表达分别上调了39%、56%和25%。EdU检测细胞增殖和流式细胞术检测细胞周期变化的结果表明,circRIPK2抑制细胞增殖进程。结论 circRIPK2可能通过抑制成肌细胞增殖、促进成肌细胞分化,从而影响鸡骨骼肌的生长发育过程。     

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

本实验旨在研究RNA干扰(RNAi)RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条si RNA(1,2,3)转染C2C12细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的si RNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外,Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明:RACK1-si RNA-2干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达70%。随后,C2C12细胞转染si RNA-2,诱导分化48h后RTqPCR表明,MHC和MyoG的m RNA表达均显著性下调(P<0.05);诱导分化72 h后,Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明,干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达,提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。     

山羊MGAT5基因克隆及其在不同组织和成肌分化过程中的表达研究

为了探究山羊糖基化酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl transferase, MGAT) 5基因序列信息及其在不同组织和成肌细胞分化过程中的表达变化,试验以罕山白绒山羊为研究对象,利用PCR技术克隆了山羊MGAT5基因编码序列(coding sequence, CDS),并对其进行了生物信息学分析,同时利用反转录荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)与Western-blot技术检测MGAT5基因在山羊不同组织(心脏、肺脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌)及成肌细胞分化过程中的表达情况。结果表明：山羊MGAT5基因CDS全长为2 220 bp,编码739个氨基酸,与绵羊MGAT5基因亲缘性较高,与小鼠亲缘性较远;MGAT5蛋白的等电点为8.49,为稳定蛋白;MGAT5基因在罕山白绒山羊在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌均有表达,在肾脏中表达量最高,其次为脾脏、肺脏、心脏、肝脏,在背最长肌中表达量最低;MGAT5基因的mRNA和蛋白表达量在山羊成肌细胞分化过程中均呈逐渐降低趋势。说明MGAT5基因的表达...     

动物生肌决定因子的研究进展

本文综述了生肌决定因子(MyoD)的家族成员、分子结构、功能、定位、调节途径、变异及其与生产性能的关系,并对生肌决定因子的研究前景进行了展望。     

肉鸡成肌细胞的分离培养与鉴定

为建立肉鸡成肌细胞的体外分离、培养及鉴定体系，选取11 d鸡胚为材料，利用Ⅰ型胶原酶消化鸡胚胸肌，差速贴壁法分离纯化成肌细胞，优化成肌细胞培养条件；通过细胞形态学观察和成肌分化标志基因表达情况进行细胞鉴定，并利用含2%马血清的培养基诱导其成肌分化。结果表明:分离获得的细胞贴壁后呈纺锤形，39.5 ℃培养条件下细胞增殖速度显著高于37.0 ℃(P<0.05)；经实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测分析，增殖期与分化期均有成肌细胞的特异性标志基因成肌因子5(Myogenic factor 5，Myf5)与成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1，MyoD)的表达，且与增殖期相比，成肌细胞分化期肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)与肌肉调节因子4(Muscle regulatory factor，MRF4)基因表达量显著升高(P<0.05)；此外，细胞增殖期结蛋白(Desmin)和分化期肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC)呈阳性表达。综上，成功分离获得了肉鸡成肌细胞，并在39.5 ℃培养条件下具有更好的增殖能力，为研究肌肉发育及其营养调控机制奠定了基础。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell，BSSC），并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC，使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC，使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力，使用2%马血清诱导其分化为肌细胞，RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现，分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形，细胞形态饱满，折光性强，随着培养时间的延长，细胞由原来的无序生长变为有序生长；RT-PCR检测发现，BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达；免疫荧光染色及Western blotting结果显示，PAX7和MyoD基因均呈阳性表达；成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现；成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后，而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上，本研究成功分离获得BSSC，并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

钙离子处理对成肌细胞μ-calpain mRNA和蛋白表达的影响

本试验利用实时定量RT—PCR、酪蛋白底物酶原分析和SDS—PAGE等方法研究不同浓度钙离子对分化的大鼠L6成肌细胞中μ-calpain mRNA蛋白水平表达以及对L6细胞内蛋白的降解程度的影响。研究表明：钙离子处理可以诱导L6进一步分化为肌管，高浓度钙离子（〉1000μM）还导致L6死亡率增大；钙离子诱导μ-calpain mRNA和蛋白水平表达增加。钙离子浓度为1000μM时，μ-calpain mRNA的表达量为对照组的3倍多，但是当钙离子浓度升至1500μM时表达量却降低。50-100斗M钙离子可以使μ-calpain酶活增加两倍，而500--1500μM钙离子增加酶活5—7倍；高浓度钙离子由于提高了μ-capaln的活性，细胞内蛋白的降解代谢增强．在SDS--PAGE凝胶电泳中发现细胞上清液中有明显的蛋白条带出现。     

KLF15基因表达特征及其腺病毒超表达载体的构建

【目的】分析锌指蛋白转录因子15(KLF15)在小鼠各组织及C2C12细胞分化过程中的表达情况,构建KLF15的腺病毒超表达载体。【方法】采集小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌及培养的C2C12成肌细胞,提取不同分化时期(0,2,4d)的C2C12细胞及不同组织的RNA,检测KLF15的表达情况;过夜连接HindⅢ和XbaⅠ双酶切后的pAdTrack-CMV与KLF15真核表达质粒(pcDNA3.1-KLF15),获得pAdTrack-KLF15质粒。将该质粒经PmeⅠ线性化后转入BJ5183感受态细胞进行重组,构建pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体。将pAdEasy-KLF15质粒PacⅠ酶切线性化回收后,转染293A细胞进行包装、扩繁和纯化。将获得的KLF15重组腺病毒侵染C2C12细胞,实时荧光定量PCR检测其对KLF15表达的影响。【结果】KLF15在C2C12成肌细胞分化过程中表达显著升高,并在分化后期达最高值;KLF15在肝脏、肾脏和脂肪中的表达水平极显著高于骨骼肌和脾脏。成功获得了pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体,其侵染C2C12细胞后能显著上调KLF15mRNA的表达水平。【结论】KLF15基因在C2C12成肌细胞中高表达,并成功构建了KLF15重组腺病毒载体。